Characterization of lycopene-overproducing E. coli strains in high cell density fermentations
- 作者
- Hal Alper, Kohei Miyaoku, Gregory Stephanopoulos
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2006）
- DOI
- 10.1007/s00253-006-0357-y
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
表征两株通过系统性组合基因敲除构建的番茄红素过量生产的大肠杆菌菌株在高细胞密度发酵中的生产性能，并与亲本菌株对比，揭示其代谢特征和优化发酵条件。
研究策略
优化发酵参数（搅拌转速、pH控制策略），采用补料分批高细胞密度发酵，结合离线测定有机酸、氨基酸、番茄红素和生物量，进行碳平衡分析，比较三株菌的生产表现。
核心内容
本研究对两株通过系统性基因敲除构建的番茄红素过量生产大肠杆菌菌株（ΔgdhA ΔaceE ΔfdhF 和 ΔgdhA ΔaceE ΔpyjD）进行了高细胞密度补料分批发酵表征，并与亲本菌株对比。通过优化搅拌转速和pH控制策略，发现高氧水平和提升pH对提高比产量和体积产量至关重要。两株工程菌的最大比生产力分别达388.0和496.3 μg/g dcw h，均高于亲本的242.9 μg/g dcw h；最大体积产量分别达176.5和221.6 mg/l，最终发酵液中番茄红素产量接近220 mg/l，为当时大肠杆菌中报道的最高值。碳平衡分析显示，ΔgdhA ΔaceE ΔpyjD菌株的甲酸和谷氨酸水平显著降低（分别为0.44 g/l和2.47 mM，亲本为0.60 g/l和10.08 mM），丙氨酸亦下降。结果表明谷氨酸脱氢酶敲除降低了谷氨酸通量，增加NADPH可用性，从而促进番茄红素合成。两株工程菌生产特征各异，且均显著优于亲本，这些宿主菌株有望用于其他类胡萝卜素的生产。
创新点
首次在高细胞密度发酵中系统比较两株全局最优工程菌（ΔgdhA ΔaceE ΔfdhF 和 ΔgdhA ΔaceE ΔpyjD）与亲本菌株；发现高氧水平和提高pH对产量至关重要；碳平衡揭示谷氨酸、NADPH、甲酸和丙氨酸与番茄红素过量生产之间的关联；产量达到220 mg/l，为当时E. coli中报道的最高值。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| E. coli K12 PT5-dxs, PT5-idi, PT5-ispFD，携带pAC-LYC质粒 | 番茄红素生物合成途径（MEP途径） | — | — | 能量供给 | 宿主细胞，染色体整合过表达dxs、idi、ispFD，并提供pAC-LYC质粒表达crtEBI，为番茄红素合成提供前体异戊烯基焦磷酸。 |
| E. coli K12 PT5-dxs, PT5-idi, PT5-ispFD | 甲基赤藓醇磷酸（MEP）途径 | dxs | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 | 催化 | 染色体上过表达，增强IPP/DMAPP前体供应。 |
| E. coli K12 PT5-dxs, PT5-idi, PT5-ispFD | 甲基赤藓醇磷酸（MEP）途径 | idi | 异戊烯基二磷酸异构酶 | 催化 | 染色体上过表达，催化IPP与DMAPP相互转化。 |
| E. coli K12 PT5-dxs, PT5-idi, PT5-ispFD | 甲基赤藓醇磷酸（MEP）途径 | ispFD | IspF（2-C-甲基-D-赤藓醇2,4-环二磷酸合酶）和IspD（4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇合酶） | 催化 | 染色体上过表达，参与MEP途径。 |
| E. coli K12 PT5-dxs, PT5-idi, PT5-ispFD | 番茄红素生物合成途径 | crtEBI | GGPP合酶（CrtE）、八氢番茄红素合酶（CrtB）、八氢番茄红素去饱和酶（CrtI） | 催化 | 由pAC-LYC质粒异源表达，催化IPP聚合生成40碳番茄红素。 |
| E. coli K12 PT5-dxs, PT5-idi, PT5-ispFD | 谷氨酸代谢/中心碳代谢 | gdhA | 谷氨酸脱氢酶（NADPH依赖） | 调控 | 敲除该基因以减少谷氨酸通量和NADPH消耗，增加NADPH可用性，促进番茄红素合成。 |
| E. coli K12 PT5-dxs, PT5-idi, PT5-ispFD | 丙酮酸代谢 | aceE | 丙酮酸脱氢酶E1组分 | 调控 | 敲除该基因以调整碳通量，减少碳损失，提高番茄红素产量。 |
| E. coli K12 PT5-dxs, PT5-idi, PT5-ispFD | 甲酸代谢/混合酸发酵 | fdhF | 甲酸氢裂解酶（甲酸脱氢酶H） | 调控 | 敲除该基因以减少甲酸和副产物的碳损失，增加碳流向目标产物。 |
| E. coli K12 PT5-dxs, PT5-idi, PT5-ispFD | 未知（假设蛋白） | pyjD (yjiD) | 假设蛋白YjiD | 调控 | 敲除该基因与gdhA和aceE组合，显著降低甲酸、谷氨酸和丙氨酸水平，提高番茄红素产量，其具体功能未知。 |
关键发现
高氧水平和增加pH值对提高比产量和体积产量至关重要。两株工程菌的最比生产力分别为388.0 μg/g dcw h（ΔgdhA ΔaceE ΔfdhF）和496.3 μg/g dcw h（ΔgdhA ΔaceE ΔpyjD），均高于亲本菌株的242.9 μg/g dcw h。最大体积产量分别达到176.5 mg/l和221.6 mg/l（亲本为132.7 mg/l）。24小时总产量分别为186.2 mg和228.5 mg，总体产率（mg/g葡萄糖）分别为2.15和2.61，均高于亲本的1.58。ΔgdhA ΔaceE ΔpyjD菌株的甲酸和谷氨酸水平显著降低，分别为0.44 g/l和2.47 mM（亲本为0.60 g/l和10.08 mM），丙氨酸也降低（0.28 mM vs 0.59 mM）。最终发酵液中番茄红素产量接近220 mg/l（约27 g DCW/l），为当时E. coli中报道的最高值。
研究结论
两株工程菌在高细胞密度发酵中表现出明显优于亲本菌株的番茄红素生产性能，且两者生产特征不同。优化发酵条件（高氧、部分pH控制）结合基因敲除显著提高了产量。碳平衡表明谷氨酸通量降低（通过gdhA敲除）增加NADPH可用性，从而促进番茄红素合成。这些宿主菌株有望用于其他类胡萝卜素的生产。