Functional expression system for cytochrome P450 genes using the reductase domain of self-sufficient P450RhF from Rhodococcus sp. NCIMB 9784
- 作者
- Miho Nodate, Mitsutoshi Kubota, Norihiko Misawa
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2005）
- DOI
- 10.1007/s00253-005-0147-y
- 所属领域
- 酶工程
- 关键词
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解决的核心问题
多种细菌I类细胞色素P450依赖外源还原伴侣蛋白，功能性表达困难，缺乏通用高效的表达系统以鉴定其催化功能。
研究策略
利用Rhodococcus sp. NCIMB 9784自足型P450RhF的还原酶结构域（含FMN、NAD(P)H结合位点和[2Fe2S]铁氧还蛋白中心），构建融合表达载体pRED，将目标P450基因与还原酶域融合，在大肠杆菌中实现功能性表达。
核心内容
本研究利用Rhodococcus sp. NCIMB 9784中自足型细胞色素P450RhF的还原酶结构域，构建了通用融合表达载体pRED。该还原酶域包含FMN、NAD(P)H结合位点及[2Fe2S]铁氧还蛋白中心，与目标P450基因融合后可在Escherichia coli BL21(DE3)中实现可溶性功能表达。研究以三类I类P450为对象验证系统通用性：P450cam-Red融合蛋白在24小时内将0.5 mM(+)樟脑100%转化为5-exo-羟基樟脑，而对照菌株活性极低；P450bzo-Red在4小时内完全转化4-羟基苯甲酸为原儿茶酸，对照仅转化约一半；含P450balk-Red的菌株催化辛烷生成1-辛醇，产量达800 mg/l，是已报道的AlkB2烷烃羟化酶系统的十倍以上。该系统首次直接证明CYP153A家族P450balk具有烷烃1-单加氧酶功能，为依赖外源还原伴侣而难以功能表达的细菌I类P450提供了高效通用鉴定平台，在生物转化应用中有广阔前景。
创新点
构建了基于P450RhF还原酶结构域的通用表达载体pRED，使多种I类P450以可溶性融合蛋白形式在大肠杆菌中功能表达；首次直接证明了CYP153A家族的P450balk具有烷烃1-单加氧酶功能，催化辛烷生成1-辛醇，产量达800 mg/l。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 樟脑5-exo-羟基化 | P450cam (CYP101A) | P450cam | 催化 | 来自Pseudomonas putida ATCC17453，融合P450RhF还原酶域后（P450cam-Red）可高效催化(+)-樟脑生成5-exo-羟基樟脑。 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 4-羟基苯甲酸3-羟基化 | P450bo (CYP203A) | P450bo | 催化 | 来自环境宏基因组文库Bzo71-8，融合表达（P450bzo-Red）可催化4-羟基苯甲酸生成原儿茶酸。 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 烷烃末端羟基化 | P450balk (CYP153A) | P450balk | 催化 | 来自Alcanivorax borkumensis SK2，融合表达（P450balk-Red）首次证明其功能，可催化辛烷生成1-辛醇，产量800 mg/l。 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 电子传递 | P450RhF还原酶域基因 | P450RhF还原酶结构域（含FMN、NAD(P)H结合位点及[2Fe2S]中心） | 能量供给 | 来自Rhodococcus sp. NCIMB 9784，作为融合伴侣为P450提供电子，C端通过连接肽与目标P450相连。 |
关键发现
- P450cam-Red融合蛋白在24 h内将0.5 mM (+)樟脑100%转化为5-exo-羟基樟脑，而对照菌株活性低
- P450bzo-Red融合蛋白在4 h内完全转化4-羟基苯甲酸为原儿茶酸，对照菌株同时刻仅转化约一半
- 含pBalk-Red的大肠杆菌将辛烷转化为1-辛醇，产量达800 mg/l，是已报道的AlkB2烷烃羟化酶系统（74 mg/l）的十倍以上。
研究结论
基于P450RhF还原酶结构域的融合表达系统可广泛用于多种细菌I类P450的功能鉴定和生物转化应用，尤其适用于难以通过外源还原伴侣实现功能表达的P450。