Engineering the lycopene synthetic pathway in E. coli by comparison of the carotenoid genes of Pantoea agglomerans and Pantoea ananatis
- 作者
- Sang-Hwal Yoon, Ju-Eun Kim, Sook-Hee Lee, Hye-Min Park, Myung-Suk Choi, Jae-Yean Kim, Si-Hyoung Lee, Yong-Chul Shin, Jay D. Keasling, Seon-Won Kim
- 单位
- Division of Applied Life Science (BK21), Gyeongsang National University, Jinju 660-701, South Korea; Environmental Biotechnology National Core Research Center, Gyeongsang National University, Jinju 660-701, South Korea; Division of Forest Science, Gyeongsang National University, Jinju 660-701, South Korea; Department of Microbiology, Gyeongsang National University, Jinju 660-701, South Korea; Amicogen Inc., Jinsung, Jinju 660-852, South Korea; Department of Chemical Engineering, University of California, Berkeley, CA 94720-1462, USA
- DOI
- 10.1007/s00253-006-0623-z
- 所属领域
- 代谢工程
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解决的核心问题
比较来自Pantoea agglomerans和Pantoea ananatis的类胡萝卜素合成基因（crtE, crtB, crtI）在大肠杆菌中生产番茄红素的效率，并鉴定影响产量的关键基因。
研究策略
构建携带不同来源crt基因的质粒，在有无甲羟戊酸途径补充前体条件下比较番茄红素产量；通过基因替换（crtE互换、引入A. fulgidus gps、过表达ispA）解析限速步骤。
研究路线图
核心内容
本研究以大肠杆菌DH5α为宿主，系统比较了Pantoea agglomerans与Pantoea ananatis来源的crtE、crtB、crtI基因在番茄红素合成中的效率。通过构建携带不同来源基因簇的质粒，并结合甲羟戊酸途径前体补充和基因替换策略，解析了限速步骤。结果显示，携带P. agglomerans基因簇的菌株在无诱导条件下番茄红素产量达27 mg/L，是P. ananatis来源（需IPTG诱导，12 mg/L）的2倍以上；补充甲羟戊酸途径后两者分别提升至60和35 mg/L。基因互换实验表明，crtE编码的GGPP合酶是造成产量差异的关键因素，将其替换后P. ananatis产量回升至55 mg/L，与P. agglomerans全基因簇相当；引入A. fulgidus来源的gps产量达59 mg/L，进一步确认GGPP合酶活性充足时FPP合成不再是瓶颈，过表达ispA也无额外增益。此外，37°C培养使产量降至16 mg/L，较30°C下降3.7倍。该工作为大肠杆菌中番茄红素合成途径的异源基因选择和限速步骤解析提供了直接依据。
创新点
首次直接比较了两种Pantoea菌株的crt基因簇在大肠杆菌中的番茄红素生产效率；发现crtE是造成产量差异的关键基因；证明在高效GGPP合酶存在下FPP合成不再是限速步骤。
研究对象（13）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli DH5α | 番茄红素合成途径 | crtE | GGPP合酶 | 催化 | 来自Pantoea agglomerans，将FPP转化为GGPP |
| Escherichia coli DH5α | 番茄红素合成途径 | crtB | 八氢番茄红素合成酶 | 催化 | 来自Pantoea agglomerans，将两分子GGPP缩合为八氢番茄红素 |
| Escherichia coli DH5α | 番茄红素合成途径 | crtI | 八氢番茄红素脱氢酶 | 催化 | 来自Pantoea agglomerans，引入双键生成番茄红素 |
| Escherichia coli DH5α | 番茄红素合成途径 | crtE | GGPP合酶 | 催化 | 来自Pantoea ananatis，将FPP转化为GGPP，活性较P. agglomerans版本低 |
| Escherichia coli DH5α | 番茄红素合成途径 | crtB | 八氢番茄红素合成酶 | 催化 | 来自Pantoea ananatis，将两分子GGPP缩合为八氢番茄红素 |
| Escherichia coli DH5α | 番茄红素合成途径 | crtI | 八氢番茄红素脱氢酶 | 催化 | 来自Pantoea ananatis，引入双键生成番茄红素 |
| Escherichia coli DH5α | 类胡萝卜素前体合成 | idi | IPP异构酶 | 催化 | 来自E. coli，将IPP异构化为DMAPP |
| Escherichia coli DH5α | 类胡萝卜素前体合成 | ipiHP1 | IPP异构酶 | 催化 | 来自Haematococcus pluvialis，将IPP异构化为DMAPP |
| Escherichia coli DH5α | 类胡萝卜素前体合成 | ispA | FPP合酶 | 催化 | 来自E. coli，催化IPP和DMAPP生成FPP |
| Escherichia coli DH5α | 番茄红素合成途径 | gps | 多功能GGPP合酶 | 催化 | 来自Archaeoglobus fulgidus，可直接从IPP和DMAPP合成GGPP |
| Escherichia coli DH5α | 甲羟戊酸途径 | mvaK1 | 甲羟戊酸激酶 | 催化 | 来自Streptococcus pneumoniae，磷酸化甲羟戊酸 |
| Escherichia coli DH5α | 甲羟戊酸途径 | mvaK2 | 磷酸甲羟戊酸激酶 | 催化 | 来自Streptococcus pneumoniae，磷酸化甲羟戊酸-5-磷酸 |
| Escherichia coli DH5α | 甲羟戊酸途径 | mvaD | 甲羟戊酸-5-焦磷酸脱羧酶 | 催化 | 来自Streptococcus pneumoniae，脱羧产生IPP |
关键发现
- 携带P. agglomerans crt基因的大肠杆菌无IPTG诱导时产番茄红素27 mg/L，是携带P. ananatis crt基因（0.1 mM IPTG诱导，12 mg/L）的2倍
- 引入甲羟戊酸底部途径后，P. agglomerans产量升至60 mg/L，P. ananatis升至35 mg/L
- 用P. agglomerans crtE替换P. ananatis crtE后产量达55 mg/L，与P. agglomerans全基因簇效果相似
- 用A. fulgidus gps替换后产量59 mg/L，与P. agglomerans crtE无显著差异
- 在37°C培养时产量降至16 mg/L，比30°C低3.7倍
- crtE、crtB、crtI的序列同源性分别为55%、64%、77%
- 过表达ispA未进一步提高产量（58 mg/L vs 60 mg/L）。
研究结论
研究表明，P. agglomerans的crt基因比P. ananatis的更适合大肠杆菌番茄红素生产，差异主要由crtE决定；当GGPP合酶活性充足时，FPP合成不是限速步骤，过表达ispA无额外增益。