Isolation and characterization of a carotenoid oxygenase gene from Chlorella zofingiensis (Chlorophyta)
- 作者
- Jun-Chao Huang, Yan Wang, Gerhard Sandmann, Feng Chen
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2005）
- DOI
- 10.1007/s00253-005-0166-8
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
分离和鉴定小球藻Chlorella zofingiensis中参与虾青素合成的类胡萝卜素加氧酶基因crtO，并阐明其功能及虾青素生物合成途径。
研究策略
设计简并引物通过RT-PCR和RACE克隆crtO cDNA及其基因；利用Southern blot分析拷贝数；在大肠杆菌中通过共转化进行功能互补实验；采用RT-PCR检测葡萄糖诱导下的基因表达。
核心内容
从绿藻Chlorella zofingiensis中克隆并鉴定了参与虾青素合成的类胡萝卜素加氧酶基因crtO。通过简并引物RT-PCR和RACE获得全长cDNA及基因组序列，该基因开放阅读框编码312个氨基酸，含3个内含子，基因组中为单拷贝，GC含量51.1%。在大肠杆菌中的功能互补实验表明，CRTO具有双功能催化活性：既能将β-胡萝卜素经海胆酮转化为角黄素，也能将玉米黄质经adonixanthin高效转化为虾青素。该酶与雨生红球藻BKT的氨基酸序列一致性为53%。在2%葡萄糖诱导下，crtO mRNA水平在24小时达到峰值后下降，而未处理细胞中表达水平极低且稳定。研究首次报道了来自真核藻类的双功能类胡萝卜素加氧酶，据此提出C. zofingiensis中虾青素主要通过玉米黄质途径合成，即玉米黄质→adonixanthin→虾青素，而角黄素因羟化步骤效率低而积累。该crtO基因适用于在富含玉米黄质的宿主中异源生产虾青素。
创新点
首次报道了来自真核藻类的双功能类胡萝卜素加氧酶，该酶既能将β-胡萝卜素转化为角黄素，又能高效地将玉米黄质转化为虾青素；据此提出了虾青素生物合成的新途径。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Chlorella zofingiensis | 虾青素生物合成途径 | crtO | CRTO（类胡萝卜素4,4'-β-紫罗酮环加氧酶） | 催化 | 双功能酶：将β-胡萝卜素转化为角黄素，并将玉米黄质转化为虾青素 |
| Escherichia coli JM109 | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtO | CRTO | 催化 | 异源功能互补验证，与pACCAR16ΔcrtX或pACCAR25ΔcrtX共转化 |
关键发现
- 克隆获得crtO基因，其开放阅读框编码312个氨基酸，含3个内含子（243、318、351 bp）
- 基因组中仅有单一拷贝
- GC含量51.1%。功能互补实验表明，CRTO具有双功能活性：将β-胡萝卜素经海胆酮转化为角黄素，以及将玉米黄质经adonixanthin转化为虾青素。2%葡萄糖处理下，crtO mRNA水平在24小时达到峰值，随后下降
- 未处理细胞中crtO表达水平很低且稳定。该酶与已知H. pluvialis BKT氨基酸序列一致性为53%。
研究结论
C. zofingiensis中只有一个双功能的crtO基因，其虾青素生物合成主要通过玉米黄质途径，即玉米黄质→adonixanthin→虾青素；角黄素因羟化酶转化效率低而积累。该crtO基因适用于在富含玉米黄质的宿主中生产虾青素。