Analysis of mating-dependent transcription of Blakeslea trispora carotenoid biosynthesis genes carB and carRA by quantitative real-time PCR
- 作者
- André D. Schmidt, Thorsten Heinekamp, Markus Matuschek, Burghard Liebmann, Claus Bollschweiler, Axel A. Brakhage
- 单位
- Department of Molecular and Applied Microbiology, Leibniz-Institute for Natural Products Research and Infection Biology, Hans-Knoell-Institute; BASF, Fine Chemicals & Biocatalysis Research
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2005）
- DOI
- 10.1007/s00253-005-1941-2
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
阐明三孢布拉霉中类胡萝卜素生物合成基因carB和carRA在交配条件下的转录调控机制，确定β-胡萝卜素产量上升是否源于这些基因的转录水平增加。
研究策略
分离carB和carRA基因并测序；以翻译延伸因子1α基因tef1为内参，建立SYBR Green实时定量PCR方法；比较交配与非交配培养条件下基因的mRNA稳态水平，并用Northern blot验证。
核心内容
该研究以三孢布拉霉为对象，探究交配诱导β-胡萝卜素产量上升是否源于carB和carRA基因的转录上调。通过分离并测序这两个类胡萝卜素生物合成基因，以翻译延伸因子tef1为内参，建立了SYBR Green实时定量PCR方法，比较交配与非交配条件下的mRNA稳态水平，并用Northern blot验证。结果显示，交配培养中carRA和carB在24小时分别被诱导36倍和41倍，48小时达到最大128倍和148倍，72小时回落至87倍和103倍；而非交配培养仅有10至15倍的轻微诱导，β-胡萝卜素产量在交配时增加13至15倍。测序还揭示了carB编码区一处A到C突变（缬氨酸替换为甘氨酸）、carRA 3'端一段347-bp倒置重复及11-bp插入序列，并发现car基因启动子区域存在新的MOT3调控蛋白结合位点。这些结果表明，交配诱导的产量提升主要由carB和carRA的转录强烈上调驱动，提示利用交配非依赖的强启动子（如tef1）过表达这两个基因，有望实现无需异型菌株共培养的类胡萝卜素工业化生产。
创新点
首次通过定量实时PCR分析了B. trispora交配过程中carB和carRA的转录动态；在car基因启动子区域发现了新的MOT3调控蛋白结合位点；在carRA 3'区域发现347-bp倒置重复和11-bp插入序列。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Blakeslea trispora (ATCC14271+ / ATCC14272-) | 类胡萝卜素生物合成途径 | carB | 八氢番茄红素脱氢酶 | 催化 | 催化八氢番茄红素脱氢生成番茄红素 |
| Blakeslea trispora (ATCC14271+ / ATCC14272-) | 类胡萝卜素生物合成途径 | carRA | 双功能酶（番茄红素环化酶/八氢番茄红素合酶） | 催化 | R域具有番茄红素环化酶活性，A域具有八氢番茄红素合酶活性 |
关键发现
- 交配条件下carRA和carB转录显著诱导：24 h时分别为36倍和41倍，48 h达最大128倍和148倍，72 h降至87倍和103倍
- 非交配培养中48 h和72 h有10-15倍轻微诱导。β-胡萝卜素产量在交配时增加13-15倍。此外，测序发现carB基因编码区一处A→C突变导致缬氨酸替换为甘氨酸，carRA 3'端存在347-bp倒置重复和11-bp插入（GTGTGTTTTGT）。
研究结论
B. trispora中β-胡萝卜素产量的交配诱导是由carB和carRA基因的转录水平强烈上调引起的；通过使用交配非依赖的强启动子（如tef1）过表达这两个基因，可能实现无需异型菌株共培养的类胡萝卜素工业生产。