Biochemical characterization of the decaprenyl diphosphate synthase of Rhodobacter sphaeroides for coenzyme Q10 production
- 作者
- Hossein Shahbani Zahiri, Kambiz Akbari Noghabi, Yong Chul Shin
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2006）
- DOI
- 10.1007/s00253-006-0524-1
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
表征球形红杆菌（Rhodobacter sphaeroides）的癸异戊二烯二磷酸合酶（Rsdds），评估其用于辅酶Q10生产的催化活性与产物特异性，并与农杆菌来源的Atdds进行比较。
研究策略
从R. sphaeroides克隆rsdds基因并在大肠杆菌中异源表达；通过HPLC分析重组菌的CoQ10产量和CoQ9副产物；纯化His标签Rsdds酶，进行体外动力学表征和TLC产物分析；比较Rsdds与Atdds的体内外催化性能。
核心内容
该研究从球形红杆菌中克隆了编码癸异戊二烯二磷酸合酶的rsdds基因，并在大肠杆菌中异源表达，系统评估了其合成辅酶Q10的潜力。通过体内HPLC分析、体外酶动力学表征及TLC产物分析，首次将Rsdds与系统发育关系较远的农杆菌来源Atdds在CoQ10生产效率与产物特异性上进行了直接比较。结果表明，携带rsdds的重组菌CoQ10产量为408 μg/gDCW，经0.1 mM IPTG诱导后提升至845 μg/gDCW；而携带atdds的对照菌株诱导后产量反而下降至356 μg/gDCW。Rsdds催化产生的CoQ9副产物远少于Atdds，展现出更高的产物特异性。体外动力学显示，以法尼基二磷酸为最适底物时，其Vmax为264.6 pmol/min，KM为13.1 μM，最佳MgCl2和Triton X-100浓度分别为5 mM和0.3%。纯化后的Rsdds分子量约38.1 kDa。该研究证实Rsdds虽催化活性略低于Atdds，但可通过诱导表达弥补，其高产物特异性为微生物发酵生产高纯度CoQ10提供了有应用价值的酶源。
创新点
首次对系统发育关系最远的两种细菌DPPS酶（Rsdds和Atdds）在CoQ10生产效率与产物特异性方面进行直接比较；揭示了Rsdds具有更高的产物特异性但较低的催化活性；报道了Rsdds的详细动力学参数。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli DH5α, E. coli M15 | 辅酶Q10生物合成途径（类异戊二烯侧链合成） | rsdds | decaprenyl diphosphate synthase (Rsdds) | 催化 | 来自Rhodobacter sphaeroides 2.4.1，编码333个氨基酸，GenBank登录号AY847292；负责催化十异戊二烯二磷酸（C50）合成，作为CoQ10侧链前体 |
| Escherichia coli DH5α | 辅酶Q10生物合成途径（类异戊二烯侧链合成） | atdds (ddsA) | decaprenyl diphosphate synthase (Atdds) | 催化 | 来自Agrobacterium tumefaciens，作为与Rsdds比较的对应酶 |
| Escherichia coli | 甲基赤藓醇磷酸途径（内源IPP合成） | idi | isopentenyl diphosphate isomerase (IDI) | 催化 | 图中提及的参与IPP供应的内源酶 |
| Escherichia coli | 类异戊二烯前体合成 | ispA (FPPS) | farnesyl diphosphate synthase (FPPS) | 催化 | 催化合成FPP，作为DPPS的引物底物 |
| Escherichia coli | 泛醌侧链合成 | ispB (OPPS) | octaprenyl diphosphate synthase (OPPS) | 催化 | 内源合成C40侧链，产生CoQ8 |
| Escherichia coli | 辅酶Q10生物合成（苯醌头部转移） | ubiA | 4-hydroxybenzoate polyprenyltransferase (UbiA) | 催化 | 催化4-羟基苯甲酸与聚异戊二烯二磷酸的缩合 |
| Escherichia coli | 辅酶Q10生物合成（醌环修饰） | ubiB, ubiD, ubiG, ubiH, ubiE, ubiF | UbiB, UbiD, UbiG, UbiH, UbiE, UbiF | 催化 | 参与醌环修饰反应的一系列酶 |
关键发现
- 重组大肠杆菌PTR（携带rsdds）的CoQ10产量为408±35 μg/gDCW，经0.1 mM IPTG诱导后可提高到845±33 μg/gDCW
- 而携带atdds的PTA菌株未诱导时CoQ10产量为637±15 μg/gDCW，诱导后降至356±30 μg/gDCW。Rsdds的CoQ9副产物远少于Atdds（Atdds的CoQ9约为CoQ10的12%）。体外动力学参数：以FPP为最适底物时Vmax=264.6 pmol/min，KM=13.1 μM，kcat=8.8 1/min，kcat/KM=0.67
- IPP的Vmax=256.5 pmol/min，KM=13.8 μM，kcat=8.6 1/min
- GPP的Vmax=122 pmol/min，KM=18.5 μM
- GGPP的Vmax=105 pmol/min，KM=11.5 μM。最佳MgCl2浓度为5 mM，最佳Triton X-100浓度为0.3%
- 去除KCl后活性从150降至103 pmol/min。重组酶纯化后分子量约38.1 kDa。
研究结论
Rsdds是一种功能性DPPS，在异源大肠杆菌中能有效合成CoQ10，且产物特异性高于Atdds，表现为更少的CoQ9副产物。尽管其体内催化活性低于Atdds，但通过诱导表达可弥补该不足。Rsdds以FPP为最适底物，动力学特征与其他来源DPPS相似。研究为CoQ10的微生物生产提供了有应用潜力的酶源。