Engineering the isobutanol biosynthetic pathway in Escherichia coli by comparison of three aldehyde reductase/alcohol dehydrogenase genes
- 作者
- Shota Atsumi, Tung-Yun Wu, Eva-Maria Eckl, Sarah D. Hawkins, Thomas Bueller, James C. Liao
- 单位
- Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of California, Los Angeles, CA 90095, USA; Department of Chemical Engineering, National Tsing-Hua University, Hsinchu 30043 Taiwan, Republic of China; Gevo, Inc, Englewood, CO 80112, USA
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2009）
- DOI
- 10.1007/s00253-009-2085-6
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
在大肠杆菌异丁醇生物合成途径中，比较三种醛还原酶/醇脱氢酶基因对异丁醇产量的影响，并选择最适合的酶。
研究策略
通过基因敲除和过表达比较YqhD、Adh2和AdhA对异丁醇生产的影响，并体外测定酶动力学参数和蛋白可溶性。
核心内容
该研究在大肠杆菌中系统比较了三种醛还原酶/醇脱氢酶基因（yqhD、ADH2和adhA）对异丁醇生物合成的影响，旨在筛选最适合异丁醛还原为异丁醇的酶。通过基因敲除与过表达实验发现，内源YqhD是异丁醛还原的关键酶，删除yqhD使异丁醇产量下降80%。在无额外ADH过表达时，菌株JCL260/pSA69/pSA129可产生7.4 g/L异丁醇；在ΔyqhD背景下过表达ADH2反而使产量从6.8 g/L降至3.8 g/L，并积累2.7 g/L异丁醛，而过表达adhA则不影响产量。体外酶动力学测定表明，Adh2对异丁醛的Km高达385 mM，亲和力极低；来自乳酸乳球菌的AdhA则具有最高的异丁醛还原活性，且依赖NADH辅因子。综合比较后，AdhA因其高活性和辅因子偏好更适合在大肠杆菌异丁醇合成途径中应用，该研究为异丁醇生产菌株的酶选择提供了明确依据。
创新点
发现内源YqhD是异丁醛还原的关键酶；鉴定出来自乳酸乳球菌的AdhA具有最高的异丁醛还原活性且为NADH依赖型，适合在E. coli中应用。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 异丁醇生物合成途径 | yqhD | YqhD | 催化 | 内源广谱醇脱氢酶，催化异丁醛还原为异丁醇，对长链底物有偏好，NADPH依赖。 |
| Escherichia coli | 异丁醇生物合成途径 | ADH2 | Adh2 | 催化 | 来自酿酒酵母，对异丁醛亲和力低（Km约385 mM），在E. coli中易形成包涵体。 |
| Escherichia coli | 异丁醇生物合成途径 | adhA | AdhA | 催化 | 来自乳酸乳球菌，NADH依赖，对异丁醛活性最高，适合异丁醇生产。 |
| Escherichia coli | 异丁醇生物合成途径 | kivd | Kivd | 催化 | 来自乳酸乳球菌的2-酮酸脱羧酶，催化2-酮异戊酸脱羧生成异丁醛。 |
| Escherichia coli | 异丁醇生物合成途径 | alsS | AlsS | 催化 | 来自枯草芽孢杆菌的乙酰乳酸合酶，催化丙酮酸生成乙酰乳酸。 |
| Escherichia coli | 异丁醇生物合成途径 | ilvC | IlvC | 催化 | 来自大肠杆菌的乙酰羟酸还原异构酶，催化乙酰乳酸还原重排为2,3-二羟基异戊酸。 |
| Escherichia coli | 异丁醇生物合成途径 | ilvD | IlvD | 催化 | 来自大肠杆菌的二羟酸脱水酶，催化2,3-二羟基异戊酸脱水生成2-酮异戊酸。 |
关键发现
- 删除yqhD使异丁醇产量下降80%
- 无ADH过表达时JCL260/pSA69/pSA129产生7.4 g/L异丁醇
- 过表达ADH2的菌株在ΔyqhD背景下产量从6.8 g/L降至3.8 g/L并积累2.7 g/L异丁醛
- 过表达adhA在ΔyqhD背景下产量不下降
- Adh2对异丁醛Km高达385 mM，AdhA对异丁醛活性最高且为NADH依赖。
研究结论
在大肠杆菌异丁醇合成途径中，内源YqhD对异丁醛还原起主要作用；比较三种ADH后，乳酸乳球菌的AdhA因其NADH依赖和对异丁醛高活性而最适合作为异丁醇生产的催化剂。