Biochemical characterization of the carotenoid 1,2-hydratases (CrtC) from Rubrivivax gelatinosus and Thiocapsa roseopersicina
- 作者
- Aida Hiseni, Isabel W. C. E. Arends, Linda G. Otten
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2011）
- DOI
- 10.1007/s00253-011-3324-1
- 所属领域
- 酶工程
- 关键词
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解决的核心问题
表征两种光合细菌来源的类胡萝卜素1,2-水合酶（CrtC）的生化特性，评估其作为生物催化剂用于绿色水合反应合成叔醇的潜力。
研究策略
将Rubrivivax gelatinosus和Thiocapsa roseopersicina的crtC基因克隆至pET15b载体并在E. coli BL21(DE3)中异源表达，经亲和纯化后研究酶学性质、动力学参数、底物特异性、pH/温度稳定性及金属离子影响。
核心内容
本研究将Rubrivivax gelatinosus与Thiocapsa roseopersicina的类胡萝卜素1,2-水合酶基因crtC克隆至pET15b载体并在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达，经亲和纯化后系统表征了两种酶的生化特性。两种CrtC均无需辅因子即可催化番茄红素水合生成1-HO-番茄红素与1,1'-(HO)₂-番茄红素，总转化率约30%，单双羟基化产物比例为2:1。动力学分析显示RgCrtC的Km为24 μM、Vmax为0.31 nmol h⁻¹ mg⁻¹，TtCrtC的Km为9.5 μM、Vmax为0.15 nmol h⁻¹ mg⁻¹，两者催化效率接近。两种酶最适pH均为8.0、最适温度30°C，且能以非天然底物香叶基香叶醇（C20）反应（转化率约5%）。值得注意的是，TtCrtC在50°C孵育30分钟后仍保留30%活性而RgCrtC仅剩6%；RgCrtC在pH 9.0下保留95%活性而TtCrtC仅56%。此外，首次发现TtCrtC存在N端前脯氨酸富集区被加工的成熟现象，截短突变体保持完全活性。该工作表明两种CrtC在较宽温度与pH范围内稳定，可水合长链脂肪族底物生成叔醇，具备绿色生物催化应用潜力。
创新点
首次对T. roseopersicina的CrtC进行详细生化表征；发现两种CrtC均能以非天然底物香叶基香叶醇（C20）为底物；发现TtCrtC存在N端前脯氨酸富集区被加工的蛋白成熟现象，且截短突变体保持完全活性。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtC (Rubrivivax gelatinosus) | RgCrtC | 催化 | 重组表达并纯化的类胡萝卜素1,2-水合酶，催化番茄红素水合生成1-HO-番茄红素和1,1'-(HO)2-番茄红素 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtC (Thiocapsa roseopersicina) | TtCrtC | 催化 | 重组表达并纯化的类胡萝卜素1,2-水合酶，存在N端前脯氨酸富集区加工现象，截短突变体仍保持完全活性 |
关键发现
- 两种CrtC均无需辅因子即可催化番茄红素水合生成1-HO-番茄红素和1,1'-(HO)2-番茄红素，转化率30%，单/双羟基化产物比例2:1
- 最适pH为8.0，最适温度为30°C
- RgCrtC的Km为24 μM，Vmax为0.31 nmol h-1 mg-1
- TtCrtC的Km为9.5 μM，Vmax为0.15 nmol h-1 mg-1
- 催化效率（kcat/Km）分别为0.16 s-1 M-1和0.19 s-1 M-1
- 对香叶基香叶醇的转化率约5%
- TtCrtC在50°C孵育30 min后仍保留30%活性，而RgCrtC仅保留6%
- RgCrtC在pH 9.0仍保留95%活性，TtCrtC仅56%。
研究结论
RgCrtC和TtCrtC在较宽的温度和pH范围内稳定，能够水合长链脂肪族底物生成叔醇，具有作为绿色生物催化剂的潜力。