cDNA cloning of a novel gene codifying for the enzyme lycopene β-cyclase from Ficus carica and its expression in Escherichia coli
- 作者
- José Miguel Araya-Garay, Lucía Feijoo-Siota, Patricia Veiga-Crespo, Tomás González Villa
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2011）
- DOI
- 10.1007/s00253-011-3488-8
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
无花果中类胡萝卜素合成途径的基因尚未被鉴定，β-胡萝卜素作为重要营养素和抗氧化剂市场需求大，而生物法产量低，需要克隆关键酶基因用于异源生产。
研究策略
通过RT-PCR和RACE-PCR从无花果叶片中克隆番茄红素β-环化酶基因全长cDNA，构建pET21-Lycβ表达载体，在大肠杆菌BL21(DE3)中进行异源表达，利用颜色互补实验和HPLC验证酶活性与产物。
核心内容
该研究首次从无花果叶片中克隆了编码番茄红素β-环化酶的基因Lyc-βFc，并验证了其在大肠杆菌中高效合成β-胡萝卜素的功能。研究者通过RT-PCR和RACE-PCR获取全长cDNA，该基因开放阅读框长1488 bp，编码496个氨基酸，表观分子量约56 kDa，与柑橘、猕猴桃等植物来源的β-环化酶序列相似性达74%至77%。将Lyc-βFc构建至pET21载体后转化至积累番茄红素的大肠杆菌BL21(DE3)菌株，通过颜色互补实验和HPLC确认酶活性，结果显示番茄红素向β-胡萝卜素的转化率高达91%，重组菌β-胡萝卜素含量达到529 μg/g干重，且未检测到中间产物γ-胡萝卜素，证明该酶能够高效催化番茄红素两端的连续环化反应。这一工作不仅填补了无花果类胡萝卜素合成途径基因鉴定的空白，所克隆的Lyc-βFc也为β-胡萝卜素及虾青素等萜类化合物的微生物异源生产提供了新的高效酶元件。
创新点
首次从无花果中克隆并鉴定类胡萝卜素合成途径基因Lyc-βFc，并在大肠杆菌中实现功能性表达，该酶能同时催化番茄红素两端的环化反应。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 类胡萝卜素生物合成 | Lyc-β Fc | Lycopene β-cyclase | 催化 | 来自无花果，催化番茄红素两端环化生成β-胡萝卜素 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 类胡萝卜素生物合成 | crtE | GGPP synthase | 催化 | 来自Erwinia uredovora，催化FPP/GPP生成GGPP |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 类胡萝卜素生物合成 | crtB | Phytoene synthase | 催化 | 来自Erwinia uredovora，催化GGPP形成八氢番茄红素 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 类胡萝卜素生物合成 | crtI | Phytoene desaturase | 催化 | 来自Erwinia uredovora，催化八氢番茄红素脱氢生成番茄红素 |
关键发现
- 克隆的Lyc-βFc cDNA ORF长1488 bp，编码496个氨基酸，蛋白表观分子量56 kDa
- 与柑橘、猕猴桃等植物β-LCY相似性为74-77%
- 异源表达后番茄红素向β-胡萝卜素的转化率为91%，重组菌β-胡萝卜素含量达529 μg/g干重
- 未检测到中间产物γ-胡萝卜素，说明酶能高效完成两端环化。
研究结论
从无花果中克隆的Lyc-βFc基因编码番茄红素β-环化酶，能够在大肠杆菌中高效合成β-胡萝卜素，为β-胡萝卜素及虾青素等类胡萝卜素的代谢工程生产提供了新的基因元件。