Completing the series of BVMOs involved in camphor metabolism of Pseudomonas putida NCIMB 10007 by identification of the two missing genes, their functional expression in E. coli, and biochemical characterization
- 作者
- Maria Kadow, Kathleen Loschinski, Stefan Saß, Marlen Schmidt, Uwe T. Bornscheuer
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2012）
- DOI
- 10.1007/s00253-011-3859-1
- 所属领域
- 酶工程 / 生物催化
- 关键词
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解决的核心问题
完成樟脑降解代谢中Baeyer-Villiger单加氧酶系列缺失的两个酶——3,6-diketocamphane 1,6-monooxygenase (3,6-DKCMO) 和 2-oxo-Δ3-4,5,5-trimethylcyclopentylacetyl-CoA monooxygenase (OTEMO)——的基因鉴定、重组表达与生化表征，从而补齐该通路所有BVMO的可用性。
研究策略
利用基因步移PCR从含CAM质粒的基因组DNA中鉴定缺失基因，克隆至pET-28b载体，在E. coli BL21(DE3)中表达；通过伴侣蛋白GroES/GroEL共表达改善3,6-DKCMO可溶性；对酶进行His-tag亲和纯化，并通过光谱法测定NADPH消耗及GC分析底物转化来表征底物特异性和动力学。
研究路线图
核心内容
本研究完成了恶臭假单胞菌樟脑降解途径中两种关键Baeyer-Villiger单加氧酶——3,6-DKCMO和OTEMO——的基因鉴定、重组表达与生化表征，补齐了该代谢通路上所有BVMO的可用性。通过基因步移PCR从含CAM质粒的基因组DNA中鉴定出缺失基因，克隆至pET-28b载体并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，其中3,6-DKCMO需与伴侣蛋白GroES/GroEL共表达方可获得可溶性蛋白。纯化后酶学表征显示，OTEMO对(±)-cis-bicyclo[3.2.0]hept-2-en-6-one的kcat/KM达49.3 mM⁻¹s⁻¹，最适pH 9、最适温度23 °C，但热稳定性有限，30 °C下半衰期仅9 min。生物转化实验中，3,6-DKCMO对(-)-樟脑转化率达91%，OTEMO对底物13的转化达100%，两者纯化得率分别为56 mg/600 ml和63 mg/300 ml培养。序列分析显示OTEMO与Novosphingobium aromaticivorans CHMO同源性达78%。该研究使樟脑降解通路的系列BVMO全部获得重组版本，为后续蛋白工程改造及工业生物催化应用奠定了基础，但DKCMO型酶的高效催化体系仍需匹配适当的FMN还原酶。
创新点
首次克隆并重组表达了3,6-DKCMO和OTEMO，使樟脑降解途径的三种BVMO均可通过重组表达获得；发现3,6-DKCMO需伴侣蛋白共表达才可溶；证明OTEMO对双环酮和α,β-不饱和单环酮具有独特底物偏好。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| E. coli BL21(DE3) | 樟脑降解代谢通路 | 3,6-DKCMO (JQ034404) | 3,6-diketocamphane 1,6-monooxygenase | 催化 | type II BVMO，FMN/NADH依赖，与GroES/GroEL共表达实现可溶表达 |
| E. coli BL21(DE3) | 樟脑降解代谢通路 | OTEMO (JQ034405) | 2-oxo-Δ3-4,5,5-trimethylcyclopentylacetyl-CoA monooxygenase | 催化 | type I BVMO，FAD/NADPH依赖，最适pH 9，最适温度23 °C |
| Pseudomonas putida NCIMB 10007 | 樟脑降解代谢通路 | 2,5-DKCMO | 2,5-diketocamphane 1,2-monooxygenase | 催化 | 此前已克隆，本文用于序列和底物特异性比较 |
关键发现
- OTEMO对(±)-cis-bicyclo[3.2.0]hept-2-en-6-one的kcat/KM为49.3 mM^-1 s^-1，对环丁酮为14.7 mM^-1 s^-1
- OTEMO最适pH 9，最适温度23 °C，在20 °C、25 °C、30 °C半衰期分别为196 min、43 min、9 min
- 3,6-DKCMO纯化得率56 mg/600 ml培养，OTEMO得率63 mg/300 ml培养
- 生物转化中3,6-DKCMO对(-)-樟脑转化91%，对13转化99%，OTEMO对12转化96%、对13转化100%
- 3,6-DKCMO与2,5-DKCMO蛋白序列同源性46%，OTEMO与Novosphingobium aromaticivorans CHMO同源性78%。
研究结论
3,6-DKCMO和OTEMO可在大肠杆菌中高效重组表达，结合此前2,5-DKCMO的成功表达，樟脑降解通路中的系列BVMO已全部获得重组版本，为蛋白工程和工业应用奠定基础；但DKCMO型酶仍需鉴定合适的FMN还原酶以构建高效催化体系。