High-temperature sorbose fermentation with thermotolerant Gluconobacter frateurii CHM43 and its mutant strain adapted to higher temperature
- 作者
- Hiromi Hattori, Toshiharu Yakushi, Minenosuke Matsutani, Duantip Moonmangmee, Hirohide Toyama, Osao Adachi, Kazunobu Matsushita
- 单位
- Department of Biological Chemistry, Faculty of Agriculture, Yamaguchi University, Yamaguchi 753-8515, Japan; Department of Microbiology, Faculty of Science, King Mongkut's University of Technology Thonburi, Bangkok 10140, Thailand; Department of Bioscience and Biotechnology, Faculty of Agriculture, University of the Ryukyus, 1 Senbaru, Nishihara-cho, Okinawa 903-0213, Japan
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2012）
- DOI
- 10.1007/s00253-012-4005-4
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
高温下Gluconobacter frateurii CHM43的L-山梨糖发酵效率低，需开发耐高温菌株以降低工业冷却成本。
研究策略
通过连续传代适应性进化获得耐高温菌株CHM43AD，比较野生型与突变株的D-山梨醇氧化呼吸链酶活性和PQQ产生，并进行无温控罐发酵验证。
核心内容
该研究针对高温下Gluconobacter frateurii CHM43进行L-山梨糖发酵效率低的问题，通过连续传代适应性进化获得了耐高温突变株CHM43AD，并系统比较了两株菌在D-山梨醇氧化呼吸链中的酶活性、PQQ合成能力及发酵表现。结果表明，在38.5°C摇瓶培养中，适应株能将近100%的D-山梨醇转化为L-山梨糖，而野生型仅转化60%；罐发酵中适应株在39°C可完全转化10%的D-山梨醇，40°C时转化约60%，野生型则几乎不生长。机制分析显示，CHM43AD的膜结合GLDH活性约为野生型的2倍，其PQQ产量按细胞量计算也高出约2倍；外源添加PQQ可使野生型酶活性提高1.6–1.7倍并接近适应株水平，而未加PQQ的膜在38°C处理1小时后活性下降60–70%，40°C几乎完全失活，加PQQ的膜在40°C仍保持活性，表明适应株通过提高PQQ合成维持GLDH全酶形式，从而增强热稳定性和催化效率。在无温控罐发酵中，适应株在温度升至41.5°C时仍能继续生长，而野生型在40°C即停止生长。该研究揭示了PQQ在高温发酵中的关键作用，为降低工业冷却成本提供了可行的菌株改造策略。
创新点
（1）获得稳定耐高温的G. frateurii CHM43AD菌株；（2）揭示PQQ产量增加通过维持GLDH全酶形式增强热稳定性；（3）实现无温控的L-山梨糖发酵，最高可耐受41.5°C。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Gluconobacter frateurii CHM43 | D-山梨醇氧化呼吸链 | sldAB | PQQ依赖的甘油脱氢酶 (GLDH) | 催化 | 野生型菌株在高温下GLDH易脱辅基，活性下降，是D-山梨醇氧化的限制步骤。 |
| Gluconobacter frateurii CHM43AD | D-山梨醇氧化呼吸链 | sldAB | PQQ依赖的甘油脱氢酶 (GLDH) | 催化 | 适应菌株，sldAB序列与野生型相同，但PQQ产量更高，维持全酶形式，故热稳定性增强。 |
| Gluconobacter frateurii CHM43 | PQQ生物合成 | pqqABCDE | — | 催化 | PQQ生物合成基因簇，适应菌株中表达增加导致PQQ产量提高。 |
| Gluconobacter frateurii CHM43 | D-山梨醇氧化呼吸链 | — | 含FAD和血红素c的山梨醇脱氢酶 (SLDH) | 催化 | 也催化山梨醇氧化，但非主要负责L-山梨糖生产，活性低于GLDH。 |
| Gluconobacter frateurii CHM43 | D-山梨醇氧化呼吸链 | — | 细胞色素bo3泛醇氧化酶 | 能量供给 | 终端氧化酶，活性显著高于GLDH，不是呼吸链限制步骤。 |
关键发现
- 在38.5°C摇瓶培养中，适应株CHM43AD能将近100%的D-山梨醇转化为L-山梨糖，而野生型仅转化60%。在罐发酵中，CHM43AD在39°C完全转化10% D-山梨醇，40°C时转化约60%
- 野生型几乎不生长。酶活性比较显示，38.5°C培养的CHM43AD膜GLDH活性约为野生型的2倍，PQQ处理后野生型活性提高1.6-1.7倍并接近适应株，而适应株几乎不受PQQ影响。热稳定性实验表明，未加PQQ的膜在38°C处理1h后GLDH活性下降60-70%，40°C几乎完全失活
- 而PQQ处理的膜在40°C仍保持活性。CHM43AD的PQQ产量显著高于野生型，按细胞量计算约高2倍。无温控发酵中，25°C启动时CHM43AD最大生长达680 Klett单位，温度升至41.5°C仍继续生长
- 野生型在40°C停止生长，模式菌株IFO3264T在38.9°C停止。
研究结论
通过适应性进化获得的Gluconobacter frateurii CHM43AD菌株通过提高PQQ合成，使关键酶GLDH保持全酶形式，增强了其在高温下的稳定性和催化活性，从而能够在高温或无温控条件下高效进行L-山梨糖发酵，具有工业应用价值。