Downstream reactions and engineering in the microbially reconstituted pathway for Taxol
- 作者
- Ming Jiang, Gregory Stephanopoulos, Blaine A. Pfeifer
- DOI
- 10.1007/s00253-012-4016-1
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何在微生物底盘（如大肠杆菌和酿酒酵母）中有效引入并重构紫杉醇生物合成下游途径，克服植物细胞色素P450等真核酶异源表达与活性低的问题，以实现紫杉醇及其活性前体的高水平生产。
研究策略
采用代谢工程与蛋白工程相结合的策略：优化上游MVA/MEP途径以供应前体；对植物来源酶进行基因合成、N端截短/替换膜锚定肽、构建P450-CPR融合蛋白、密码子优化、低温诱导表达、基因剂量与启动子调控、以及生物反应器工艺优化等。
核心内容
该研究围绕在微生物底盘（大肠杆菌与酿酒酵母）中重构紫杉醇生物合成下游途径展开，目标是通过代谢工程与蛋白工程手段克服植物细胞色素P450等真核酶异源表达活性低的问题。研究采用综合优化策略：对植物来源酶进行基因合成、N端截短或膜锚定肽替换、密码子优化、低温诱导表达，并构建P450-CPR融合蛋白以提升功能表达；同时上游优化MEP/MVA途径以强化前体供应。在关键结果方面，通过MEP途径优化与基因表达工程，大肠杆菌中紫杉二烯产量从早期1.3 mg/L提升至约300 mg/L；借助融合P450-CPR工程酶，taxadien-5α-ol产量达到58 mg/L，但也观察到非预期羟基化异构体。酿酒酵母中紫杉二烯产量经密码子优化和代谢工程达8.7 mg/L。此外，研究对比了其他复杂天然产物如红霉素A（约4 mg/L）和棘霉素（约0.3 mg/L）的异源生产水平。这些结果表明，在微生物中实现紫杉醇完整途径的整合与高产仍面临挑战，需进一步发掘缺失酶并优化P450等下游修饰步骤。该工作提出的基因合成、N端修饰、融合蛋白及代谢平衡综合策略，为异源萜类合成提供了具有参考价值的系统方案，其未来可行性将在很大程度上取决于代谢工程领域的持续进展。
创新点
首次在大肠杆菌中通过P450-CPR融合蛋白实现紫杉烷P450酶的功能表达；通过系统性的代谢工程与表达优化，将紫杉二烯产量提升至约300 mg/L（E. coli），taxadien-5α-ol产量达到58 mg/L；提出了包括基因合成、N端修饰、融合蛋白及代谢平衡在内的异源萜类综合合成策略。
研究对象（11）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | MEP pathway | — | geranylgeranyl diphosphate synthase (GGPPS) | 催化 | 来自Erwinia herbicola或红豆杉，用于提供GGPP前体 |
| Escherichia coli | 紫杉醇生物合成 | txs | taxadiene synthase (TXS) | 催化 | 去除N端信号肽，利用T7启动子，低温诱导表达，与GGPPS共表达生产紫杉二烯 |
| Saccharomyces cerevisiae | 紫杉醇生物合成 | txs | taxadiene synthase | 催化 | 密码子优化后用于taxadiene生产，产量8.7 mg/L |
| Escherichia coli | 紫杉醇下游修饰 | taxadiene 5α-hydroxylase | cytochrome P450 taxadiene 5α-hydroxylase | 催化 | N端截短并添加MALLLAVF膜锚定肽，与CPR融合表达 |
| Escherichia coli | 紫杉醇下游修饰 | CPR | cytochrome P450 reductase (CPR) | 能量供给 | 来自Taxus cuspidata，去除跨膜区，与P450融合以共定位并提供电子 |
| Escherichia coli | 紫杉醇下游修饰 | tbt | taxane 2α-O-benzoyltransferase (TBT) | 催化 | 功能表达于E. coli（Walker and Croteau 2000b） |
| Escherichia coli | 紫杉醇下游修饰 | dbat | 10-deacetylbaccatin III-10-O-acetyl transferase (DBAT) | 催化 | 功能表达于E. coli（Walker and Croteau 2000a） |
| Escherichia coli | 紫杉醇下游修饰 | bapt | baccatin III-3-amino-3-phenylpropanoyltransferase (BAPT) | 催化 | 功能表达于E. coli（Walker et al. 2002a） |
| Escherichia coli | 紫杉醇下游修饰 | pam | phenylalanine aminomutase (PAM) | 催化 | 功能表达于E. coli（Walker et al. 2004） |
| Saccharomyces cerevisiae | 紫杉醇下游修饰 | taxoid 10β-hydroxylase | cytochrome P450 taxoid 10β-hydroxylase | 催化 | 在酵母中功能表达（Schoendorf et al. 2001） |
| — | 紫杉醇生物合成 | IDI | isopentenyl diphosphate isomerase (IDI) | 催化 | 图中提到的上游异构酶，催化IPP与DMAPP互变 |
关键发现
- 在大肠杆菌中，通过MEP途径优化和基因表达工程，紫杉二烯产量从早期1.3 mg/L提高至约300 mg/L
- 在酿酒酵母中，紫杉二烯产量为1.0 mg/L（Dejong等）和8.7 mg/L（Engels等，经密码子优化和代谢工程）
- 通过表达融合的P450-CPR工程酶，E. coli中taxadien-5α-ol产量达58 mg/L，同时产生非预期羟基化异构体
- 文中还比较了其他复杂天然产物的异源生产：红霉素A约4 mg/L，棘霉素约0.3 mg/L
- 紫杉醇生物合成途径包含约19步、11个手性中心。
研究结论
异源生物合成紫杉醇需要系统性的代谢工程和蛋白工程，目前已能在大肠杆菌和酵母中实现前两个途径中间体（紫杉二烯和taxadien-5α-ol）的生产；完整途径的整合与高产仍需发现缺失酶、并优化P450等下游修饰步骤的表达与活性，未来10年代谢工程的发展将决定该策略能否成为可行的生产路线。