高级醇 · 代谢工程文献库

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Implementation of a transhydrogenase-like shunt to counter redox imbalance during xylose fermentation in Saccharomyces cerevisiae

作者
Hiroyuki Suga, Fumio Matsuda, Tomohisa Hasunuma, Jun Ishii, Akihiko Kondo
单位
Department of Chemical Science and Engineering, Graduate School of Engineering, Kobe University; Organization of Advanced Science and Technology, Kobe University; RIKEN Biomass Engineering Program
杂志
Applied Microbiology and Biotechnology（2012）
DOI
10.1007/s00253-012-4298-3
所属领域
代谢工程
关键词
Anaplerotic pathwayMalic enzymeSaccharomyces cerevisiaeTranshydrogenase-like shuntXylose fermentation
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解决的核心问题

木糖发酵过程中辅酶偏好差异导致的NADPH/NADH氧化还原失衡，引起木糖醇积累和乙醇产量降低

研究策略

在重组木糖发酵酿酒酵母中过表达苹果酸酶(MAE1)、苹果酸脱氢酶(MDH2)和丙酮酸羧化酶(PYC2)，构建转氢酶样代谢支路，将NADH和NADP+转化为NAD+和NADPH，从而调节细胞氧化还原状态

研究路线图

100%
木糖发酵NADPH/NADH氧化还原失衡
过表达MAE1、MDH2、PYC2构建转氢酶样支路
NADH+NADP+→NAD++NADPH
乙醇产量0.38→0.39 g/g木糖（+25%）木糖醇0.28→0.19 g/g木糖
MAE1-MDH2组合最优：乙醇生产率提高40%，木糖消耗率提高41%
结论：转氢酶样支路改善氧化还原态，需优化组合避免木糖醇积累
机制：NADPH/NADP+升高，NADH/NAD+降低，苹果酸水平下降
YPH499XU/MAE1木糖消耗率提高28%
PYC2过表达致NADH/NAD+升高，木糖醇积累↑0.42 g/g
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核心内容

针对重组酿酒酵母木糖发酵中因辅酶偏好差异造成的NADPH/NADH氧化还原失衡及木糖醇积累问题，本研究在表达木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和木糖激酶的YPH499菌株中，通过过表达内源苹果酸酶（MAE1）、苹果酸脱氢酶（MDH2）和丙酮酸羧化酶（PYC2），构建了转氢酶样代谢支路，以期将NADH和NADP+转化为NAD+和NADPH，调节胞内氧化还原状态。结果显示，单独过表达MAE1效果最佳，乙醇产量达0.38 g/g木糖，较对照提高约23%，木糖醇产量从0.28降至0.19 g/g木糖，特异性木糖消耗率提升28%；组合过表达MAE1与MDH2使乙醇生产率和木糖消耗率进一步提升，乙醇收率与单基因菌株相当。然而，三基因共表达菌株虽木糖消耗率较对照提高81%，但乙醇产量降至0.27 g/g木糖，木糖醇积累加剧，且NADH/NAD+比值升高。代谢物分析证实Mae1p过表达降低了苹果酸水平并改善了NADPH/NADP+与NADH/NAD+比值。该研究首次证明在酿酒酵母中通过内源酶组合可实现转氢酶样功能，但支路各酶表达水平需精细平衡，才能有效改善木糖发酵性能。

创新点

首次在酿酒酵母中通过过表达内源线粒体苹果酸酶等酶实现转氢酶样功能，缓解木糖发酵中的氧化还原不平衡；发现Mae1p过表达可降低木糖醇产量并提高乙醇收率

研究对象（6）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Saccharomyces cerevisiae YPH499 木糖同化途径 XYL1 木糖还原酶（XR） 催化 来源于Scheffersomyces stipitis，优先使用NADPH
Saccharomyces cerevisiae YPH499 木糖同化途径 XYL2 木糖醇脱氢酶（XDH） 催化 来源于Scheffersomyces stipitis，优先使用NAD+
Saccharomyces cerevisiae YPH499 木糖同化途径 XKS1 木酮糖激酶（XK） 催化 来自S. cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae YPH499 转氢酶样支路 MAE1 苹果酸酶（Mae1p） 催化 定位于线粒体，催化苹果酸+NADP+→丙酮酸+NADPH+CO2
Saccharomyces cerevisiae YPH499 转氢酶样支路 MDH2 苹果酸脱氢酶（Mdh2p） 催化 催化草酰乙酸+NADH→苹果酸+NAD+
Saccharomyces cerevisiae YPH499 转氢酶样支路 PYC2 丙酮酸羧化酶（Pyc2p） 催化 催化丙酮酸+ATP→草酰乙酸+ADP+Pi+CO2，位于胞质

关键发现

  1. YPH499XU/MAE1菌株乙醇产量为0.38±0.01 g/g木糖，高于对照的0.31±0.01 g/g木糖
  2. 木糖醇产量从0.28±0.02降至0.19±0.01 g/g木糖
  3. 特异性木糖消耗率较对照提高28%。YPH499XU/MAE1-MDH2菌株特异性乙醇生产率为0.09±0.001 g/g干重/h，较YPH499XU/MAE1高1.25倍，较对照高40%
  4. 特异性木糖消耗率0.29±0.01 g/g干重/h，较对照高41%
  5. 乙醇产量与MAE1菌株相当(0.39±0.003)。YPH499XU/MAE1-MDH2-PYC2菌株特异性木糖消耗率0.40±0.003 g/g干重/h，较对照高81%，但乙醇产量降至0.27±0.003 g/g木糖，木糖醇产量升至0.42±0.01 g/g木糖，且NADH/NAD+比值升高。代谢物分析显示Mae1p过表达降低胞内苹果酸水平，提高NADPH/NADP+比值，降低NADH/NAD+比值。

研究结论

通过过表达Mae1p、Mdh2p和Pyc2p可在酿酒酵母中实现转氢酶样功能，调节细胞内氧化还原状态；单独过表达线粒体苹果酸酶可有效改善木糖发酵乙醇产量，但需进一步优化支路各酶的表达水平以避免木糖醇积累和氧化还原失衡加剧