高级醇 · 代谢工程文献库

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Codon modification for the DNA sequence of a single-chain Fv antibody against clenbuterol and expression in Pichia pastoris

作者
Jie-Xian Dong, Xi Xie, Da-Wei Hu, Shu-Chi Chen, Yong-Sheng He, Ross C. Beier, Yu-Dong Shen, Yuan-Ming Sun, Zhen-Lin Xu, Hong Wang, Jin-Yi Yang
单位
Guangdong Provincial Key Laboratory of Food Quality and Safety, College of Food Science, South China Agricultural University, Guangzhou, Guangdong Province 510642, People's Republic of China; Entry-Exit Inspection and Quarantine of Zengcheng, Zengcheng, Guangdong Province 511340, People's Republic of China; Shantou Environmental Monitoring Center, Shantou, Guangdong Province 515041, People's Republic of China; Shenzhen Academy of Metrology and Quality Inspection, Shenzhen, Guangdong Province 518055, People's Republic of China; Food and Feed Safety Research Unit, Southern Plains Agricultural Research Center, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, 2881 F&B Road, College Station, TX 77845-4988, USA
杂志
Applied Microbiology and Biotechnology（2013）
DOI
10.1007/s00253-013-5324-9
所属领域
发酵工程
关键词
ClenbuterolCodon optimizationExpressionPichia pastorisSingle-chain variable fragment
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解决的核心问题

克伦特罗单链抗体（CBL-scFv）在毕赤酵母中异源表达水平低，难以满足工业规模生产和免疫检测应用需求。

研究策略

根据毕赤酵母密码子偏好性对CBL-scFv基因进行重新设计和全基因合成，降低G+C含量并消除二级结构；通过qPCR确认拷贝数一致后，优化诱导时间、接种密度、甲醇浓度和pH等发酵条件；采用Ni-NTA亲和层析纯化重组抗体，并用ciELISA评估其活性。

研究路线图

100%
问题：CBL-scFv在毕赤酵母中表达量低，难以满足应用需求
策略一：依据毕赤酵母偏好性，两步法密码子优化
策略二：系统优化诱导时间、接种密度、甲醇浓度、pH
策略三：Ni-NTA亲和层析纯化，ciELISA评估活性
关键改造：替换156个核苷酸，G+C由53%降至47.2%，消除发夹结构
关键验证：qPCR确认拷贝数比值1.38，排除拷贝数影响
关键结果：摇瓶产量0.223 g/L，表达量提高2.35倍
关键结果：放大产量3.2 g/L，纯度95%
结论：高可溶性表达，ciELISA线性范围1.76–19.97 ng/mL，检出限0.77 ng/mL，适用于克伦特罗快速检测
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核心内容

针对克伦特罗单链抗体（CBL-scFv）在毕赤酵母中表达水平低的问题，该研究依据毕赤酵母密码子偏好性对目的基因进行了全基因重新设计和合成。优化过程替换了156个核苷酸，将G+C含量从53%降至47.2%，同时消除了潜在的mRNA二级结构。通过qPCR确认优化菌株与原始菌株基因拷贝数比值仅为1.38，排除了拷贝数增加对产量提升的影响。在摇瓶培养中，优化后重组抗体的产量达到0.223 g/L，为原始基因表达量的2.35倍。随后系统优化了诱导时间、接种密度、甲醇浓度和pH等发酵参数，发现pH 7.0时的表达量仅为pH 4.0时的51%，最佳条件为诱导72小时、接种密度A600=45、甲醇浓度1%。经Ni-NTA亲和层析纯化后，重组蛋白纯度达95%，分子量约41 kDa。间接竞争ELISA检测结果显示，该抗体对克伦特罗的线性检测范围为1.76–19.97 ng/mL，检出限为0.77 ng/mL，IC50为5.82 ng/mL。该研究表明密码子优化结合发酵条件调控可有效提升单链抗体的异源表达水平，所得抗体具备良好的克伦特罗识别活性，可用于食品和动物生产行业中的残留快速检测。

创新点

1. 采用两步法密码子优化策略，不仅替换非偏好密码子，还通过改变G+C含量和消除潜在发夹结构来提高翻译效率；2. 在基因拷贝数一致的情况下证明了密码子优化使表达量提高2.35倍；3. 系统优化了诱导时间、接种密度、甲醇浓度和pH，使摇瓶产量达到0.223 g/L；4. 重组抗体纯化后纯度95%，并成功应用于ciELISA检测克伦特罗。

研究对象（4）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Pichia pastoris GS115 甲醇诱导表达 CBL-scFv (FJ597759) CBL-scFv单链抗体 调控 未经密码子优化的原始基因，作为对照，表达量较低；抗体实际功能为结合克伦特罗，因五选一限制归为调控。
Pichia pastoris GS115 甲醇诱导表达 CBL-scFv (KF494185) CBL-scFv单链抗体 调控 密码子优化后的基因，表达量提高2.35倍；抗体特异性结合克伦特罗，因五选一限制归为调控。
Pichia pastoris GS115 甲醇代谢 AOX1 酒精氧化酶 催化 AOX1启动子驱动外源基因的甲醇诱导表达。
Pichia pastoris GS115 糖酵解 GAPDH 甘油醛-3-磷酸脱氢酶 催化 作为qPCR内参基因。

关键发现

  1. 密码子优化替换了124个氨基酸中156个核苷酸，G+C含量从53%降至47.2%，优化基因与原始基因相似性为79.4%；qPCR确认优化菌株与原始菌株基因拷贝数比值为1.38，排除了拷贝数影响；优化后CBL-scFv（41 kDa）在摇瓶中的产量为0.223 g/L，是原始基因表达量（0.095 g/L）的2.35倍；放大后产量约3.2 g/L，纯度达95%；ciELISA检测克伦特罗的线性范围为1.76–19.97 ng/mL，检出限0.77 ng/mL，IC50为5.82 ng/mL；优化条件下pH
  2. 0时表达量仅为pH
  3. 0时的51%，最佳诱导时间72 h、接种密度A600=45、甲醇浓度1%。

研究结论

通过密码子优化和发酵条件优化，实现了CBL-scFv在毕赤酵母中的高水平可溶性表达，纯化的重组抗体具有良好的克伦特罗识别活性，可用于食品和动物生产行业克伦特罗残留的快速免疫学检测。