A new cytochrome P450 system from Bacillus megaterium DSM319 for the hydroxylation of 11-keto-β-boswellic acid (KBA)
- 作者
- Elisa Brill, Frank Hannemann, Josef Zapp, Gerit Brüning, Johann Jauch, Rita Bernhardt
- 单位
- Department of Biochemistry, Saarland University; Department of Pharmaceutical Biology, Saarland University; Department of Organic Chemistry II, Saarland University
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2013）
- DOI
- 10.1007/s00253-013-5029-0
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
从工业菌株Bacillus megaterium DSM319中鉴定并表征一种新型细胞色素P450系统（CYP106A1及其天然氧化还原伴侣），并用于催化五环三萜类化合物11-酮-β-乳香酸(KBA)的羟基化，以制备具有更高生物利用度的新型衍生物。
研究策略
通过基因组挖掘鉴定CYP106A1及候选电子传递蛋白（一个黄素氧还蛋白和四个铁氧还蛋白），在E. coli中异源表达并纯化，用裂殖酵母的Arh1作为还原酶体外重建活性，筛选有效氧化还原伴侣；进一步构建基于B. megaterium MS941的重组全细胞催化剂，实现KBA的体内转化，并通过NMR鉴定产物结构。
核心内容
从工业菌株Bacillus megaterium DSM319中鉴定并表征了一种新型细胞色素P450系统CYP106A1及其天然氧化还原伴侣，用于催化五环三萜类化合物11-酮-β-乳香酸(KBA)的羟基化。通过基因组挖掘获得了CYP106A1及一个黄素氧还蛋白(Fld)和四个铁氧还蛋白(Fdx1-Fdx4)，在E. coli中异源表达纯化后，利用裂殖酵母Arh1还原酶在体外重建活性并筛选有效电子供体。体外实验表明，Fdx2和Fdx3作为电子供体时30分钟转化率最高，分别达79.6%和79.3%，无氧化还原伴侣时无产物生成。在基于B. megaterium MS941的全细胞转化中，共表达Arh1与Fdx2或Fdx4可将转化率提升至96.5%和98.8%，远高于仅表达CYP106A1的53.3%。产物经NMR鉴定，主要产物为7β-羟基-KBA（约80%），副产物为7β,15α-二羟基-KBA与15α-羟基-KBA的混合物。未经优化条件下，7β-羟基-KBA产量可达560.7 mg L⁻¹ day⁻¹。该研究建立了高效的体外和全细胞CYP106A1催化体系，为运用合成生物学手段修饰复杂萜类化合物、开发具有更高生物利用度的新型衍生物奠定了基础。
创新点
['首次克隆了Bacillus megaterium中细胞色素P450的天然氧化还原伴侣（黄素氧还蛋白Fld和三个铁氧还蛋白Fdx2-Fdx4）；', '发现CYP106A1能够接受黄素氧还蛋白和非[2Fe-2S]铁氧还蛋白的电子，并高效催化KBA羟基化；', '鉴定并制备了新型化合物7β-羟基-KBA和7β,15α-二羟基-KBA，其中7β-羟基-KBA为CYP106A1催化KBA的主要产物。']
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Bacillus megaterium MS941 | 11-酮-β-乳香酸(KBA)羟基化 | BMD_1855 (cyp106A1) | CYP106A1 | 催化 | 细胞色素P450单加氧酶，催化KBA羟基化生成7β-羟基-KBA、7β,15α-二羟基-KBA和15α-羟基-KBA |
| Bacillus megaterium MS941 | P450电子传递 | BMD_4866 (fld) | Fld | 能量供给 | 黄素氧还蛋白，在体外和全细胞中支持CYP106A1活性，效率较低 |
| Bacillus megaterium MS941 | P450电子传递 | BMD_1901 (fdx1) | Fdx1 | 能量供给 | [2Fe-2S]铁氧还蛋白，不能与CYP106A1有效电子传递，未参与KBA转化 |
| Bacillus megaterium MS941 | P450电子传递 | BMD_2329 (fdx2) | Fdx2 | 能量供给 | [3Fe-4S]或[4Fe-4S]铁氧还蛋白，体外活性最高之一，全细胞转化效率优 |
| Bacillus megaterium MS941 | P450电子传递 | BMD_4349 (fdx3) | Fdx3 | 能量供给 | [3Fe-4S]或[4Fe-4S]铁氧还蛋白，体外活性与Fdx2相当，全细胞效率略低 |
| Bacillus megaterium MS941 | P450电子传递 | BMD_0889 (fdx4) | Fdx4 | 能量供给 | [3Fe-4S]或[4Fe-4S]铁氧还蛋白，全细胞转化效率最高（98.8%） |
| Bacillus megaterium MS941 | P450电子传递 | arh1 (来自Schizosaccharomyces pombe) | Arh1 | 能量供给 | NADPH依赖性还原酶，作为异源电子传递成分，从NADPH向Fld/Fdx传递电子 |
关键发现
- ['CYP106A1与已知的CYP106A2序列一致性为63%，其与KBA结合的K_D为92.25±2.98 μM，Hill常数n=1.46±0.02，显示正协同结合。', '体外重构实验表明，Fdx2和Fdx3作为电子供体时转化率最高（30分钟分别为79.6±6.9%和79.3±6.4%），Fdx4为60.6±3.3%，Fld为27.2±2.6%
- 无氧化还原伴侣时无产物。', '使用Fdx2的动力学参数：V_max=5.4±0.1 nmol产物/nmol CYP106A1/min，K_M=16.5±1.2 μM。', '全细胞转化中，仅表达CYP106A1的菌株100分钟转化率53.3±5.9%
- 共表达Arh1和Fld、Fdx3、Fdx2、Fdx4时转化率分别提升至88.1±8.7%、83.6±10.4%、96.5±4.1%和98.8±0.2%。', 'CYP106A1催化KBA的主要产物为7β-羟基-KBA（约80%），副产物（约20%）为7β,15α-二羟基-KBA与15α-羟基-KBA的2:1混合物。', '在不经优化的情况下，7β-羟基-KBA的产量达到560.7 mg L⁻¹ day⁻¹。', '重组蛋白在E. coli中的表达产量为：CYP106A1 5350 nmol/L，Fld 5733 nmol/L，Fdx1 1519 nmol/L，Fdx2 3052 nmol/L，Fdx3 3592 nmol/L，Fdx4 1392 nmol/L。']
研究结论
本研究从Bacillus megaterium DSM319中鉴定了CYP106A1及其天然氧化还原伴侣（Fld和Fdx2-4），构建了高效的体外和全细胞CYP106A1系统，可将KBA转化为新型7β-羟基-KBA等衍生物，为利用合成生物学进一步修饰复杂萜类化合物、开发更高效药物提供了基础。