Characterization of novel mutants with an altered gibberellin spectrum in comparison to different wild-type strains of Fusarium fujikuroi
- 作者
- Sabine Albermann, Tino Elter, Andreas Teubner, Wolfgang Krischke, Thomas Hirth, Bettina Tudzynski
- 单位
- Institute of Plant Biology and Biotechnology, Westfalische Wilhelms Universitat Munster; Institute for Interfacial Engineering, University of Stuttgart; Fraunhofer Institute for Interfacial Engineering and Biotechnology IGB
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2013）
- DOI
- 10.1007/s00253-013-4917-7
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
通过遗传改造赤霉素生物合成途径，提高赤霉素产量并获得国际市场尚未商业化的纯GA4或GA7产物；同时比较不同野生型和突变株在受控发酵条件下的生长、产量和基因表达差异。
研究策略
利用基因删除（如敲除PPT1、DES）和UV诱变构建突变株，在平行多联发酵罐中进行补料分批发酵，控制pH、温度、溶氧等条件，比较六株菌的生长、GA产量和GA基因表达，并建立考虑GA分解的动力学模型。
研究路线图
核心内容
该研究通过基因删除和UV诱变构建了多种Fusarium fujikuroi赤霉素（GA）突变株，并在平行多联发酵罐中开展补料分批发酵，系统比较了六株菌的生长、产量及关键基因表达差异。结果显示，m567菌株的GA3产量达216 mg/L，较野生型IMI58289的140 mg/L提高约55%；而敲除DES基因的6314/ΔDES和6314/ΔDES/ΔPPT1菌株GA4产量分别达390 mg/L和420 mg/L，较GA7产生菌高80%至100%。研究首次阐明GA产量差异部分源于化学稳定性不同，28°C、pH4条件下GA4的分解速率常数（1.71×10⁻³ h⁻¹）显著低于GA3和GA7，模型预测GA4理论最大浓度可达1.3 g/L，远高于GA3/GA7的约330 mg/L。敲除PPT1虽未提高产量，但消除了红色色素利于下游纯化。该工作表明赤霉素产量同时受合成速率与分解速率调控，为发酵工艺优化及定向菌株改造提供了重要依据。
创新点
构建了GA4高产菌株6314/ΔDES/ΔPPT1；首次表明不同GA的化学稳定性差异导致产量差异，GA4比GA3和GA7更稳定；通过发酵模型预测GA理论最大浓度。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Fusarium fujikuroi | 赤霉素生物合成 | cps/ks | Cps/Ks (双功能二萜环化酶) | 催化 | 催化GGDP转化为ent-kaurene的两步环化反应 |
| Fusarium fujikuroi | 赤霉素生物合成 | des | GA4脱饱和酶 (Des) | 催化 | 催化GA4转化为GA7，为2-氧戊二酸依赖性双加氧酶 |
| Fusarium fujikuroi | 赤霉素生物合成 | P450-3 | 13-羟化酶 P450-3 | 催化 | 催化GA7转化为GA3及GA4转化为GA1；菌株6314中该基因发生点突变，导致不能合成GA3 |
| Fusarium fujikuroi | 赤霉素生物合成 | PPT1 | 4'-磷酸泛酰巯基乙胺转移酶 (Ppt1) | 催化 | 激活PKS和NRPS所需的酶，缺失后使乙酰-CoA流向异戊二烯途径；本研究显示其缺失不提高GA产量但消除色素 |
关键发现
m567的GA3产量为216 mg/L，比IMI58289的140 mg/L高约55%。6314/ΔDES和6314/ΔDES/ΔPPT1的GA4产量分别为390 mg/L和420 mg/L，比m567及GA7产生菌6314(234 mg/L)和6314/ΔPPT1(195 mg/L)高80-100%。所有菌株最终生物量约15 g/L。28°C、pH4下GA分解速率常数：GA3为4.55×10^-3 h^-1，GA4为1.71×10^-3 h^-1，GA7为6.42×10^-3 h^-1。理论上GA3/GA7最大浓度约330 mg/L，GA4可达1.3 g/L。所有菌株在氮限制后CPS/KS和DES表达水平持续高表达，无显著差异。敲除PPT1未提高GA产量，但消除了PKS来源的红色色素，有利于下游纯化。
研究结论
通过平行发酵比较，GA4产生菌(ΔDES突变株)的总GA产量最高，主要由于GA4化学稳定性高于GA3和GA7。GA产量不仅由合成速率决定，也受分解速率影响。敲除PPT1虽未提高产量，但简化了产物纯化。研究为赤霉素发酵工艺优化和菌株改造提供了依据。