Canthaxanthin production with modified Mucor circinelloides strains
- 作者
- Tamás Papp, Árpád Csernetics, Gábor Nagy, Ottó Bencsik, Enrique A. Iturriaga, Arturo P. Eslava, Csaba Vágvölgyi
- 单位
- Department of Microbiology, Faculty of Science and Informatics, University of Szeged, Közép fasor 52, 6726 Szeged, Hungary; Área de Genética, Departamento de Microbiología y Genética, University of Salamanca, Avda. Campo Charro s/n 37007, Salamanca, Spain
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2012）
- DOI
- 10.1007/s00253-012-4610-2
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
如何将细菌β-胡萝卜素酮化酶基因(crtW)稳定整合到Mucor circinelloides基因组中，实现角黄素(canthaxanthin)的高效生产，解决前期质粒转化法拷贝数低、产量低及稳定性差的问题。
研究策略
比较线性DNA片段转化、限制酶介导整合(REMI)和农杆菌介导转化(ATMT)三种方法，将Paracoccus sp. N81106的crtW基因融合真菌gpd1启动子和终止子后整合到M. circinelloides MS12基因组，筛选有丝分裂稳定转化子，并通过优化培养条件（温度、碳源、添加剂）提高角黄素产量。
核心内容
针对丝状真菌Mucor circinelloides中角黄素产量低且遗传不稳定的问题，本研究系统比较了线性DNA片段转化、限制酶介导整合（REMI）和农杆菌介导转化（ATMT）三种策略，将来源于Paracoccus sp. N81106的β-胡萝卜素酮化酶基因crtW融合真菌gpd1启动子后整合至宿主基因组。结果显示，线性片段转化和REMI所得转化子在非选择条件下传代15次以上仍保持稳定，而ATMT转化子在前三次培养中即丢失外源DNA。稳定转化子MS12+pCA8lf/1在葡萄糖培养基上25℃时产生169 μg/g干重角黄素；进一步优化碳源和温度后，以二羟基丙酮为碳源时产量达232 μg/g干重，占总类胡萝卜素的55%，较此前质粒转化法的6-13 μg/g干重提升显著。此外，转化株获得37℃存活能力而野生型不能生长，且总类胡萝卜素含量高于未转化菌，提示酮基衍生物可能反馈激活β-胡萝卜素合成。该工作首次在接合菌中实现细菌酮化酶基因的稳定基因组整合，为角黄素及虾青素的菌株开发提供了可行宿主。
创新点
首次在接合菌(zygomycete)中通过基因组整合实现细菌β-胡萝卜素酮化酶基因的稳定表达；发现携带crtW的转化株能在37℃存活而野生型不能；利用简单碳源（葡萄糖、海藻糖、二羟基丙酮、L-天冬氨酸）使角黄素产量超过200 μg/g干重。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Mucor circinelloides MS12 (leuA- pyrG-突变体) | 类胡萝卜素生物合成 | crtW | β-胡萝卜素酮化酶 (CrtW) | 催化 | 来自Paracoccus sp. N81106，将β-胡萝卜素转化为角黄素和echinenone，整合于基因组中 |
| Mucor circinelloides MS12 | 类胡萝卜素生物合成 | gpd1 | 甘油醛-3-磷酸脱氢酶 (GPD1) | 调控 | 其启动子gpd1P和终止子gpd1T用于驱动crtW基因的表达 |
| Mucor circinelloides MS12 | 类胡萝卜素生物合成 | carG | 香叶基香叶基焦磷酸合酶 | 催化 | 作为qPCR分析中单拷贝内参基因，用于确定crtW拷贝数 |
| Mucor circinelloides MS12 | 类胡萝卜素生物合成 | isoA | 异柠檬酸裂解酶 | 催化 | 作为qPCR分析中单拷贝内参基因，用于确定crtW拷贝数 |
关键发现
- 线性DNA片段转化和REMI得到的转化子在非选择条件下经15次以上传代仍保持稳定，而ATMT转化子在最初3次培养中丢失转入DNA。
- 稳定转化子MS12+pCA8lf/1和MS12+pCA9lf/1在葡萄糖培养基上（25℃）分别产生169和80 μg/g干重角黄素，占总量33%和13%；而以葡萄糖（20℃）、海藻糖、二羟基丙酮或L-天冬氨酸为碳源时，MS12+pCA8lf/1的角黄素产量均超过200 μg/g干重（如二羟基丙酮时232 μg/g，占55%）。
- 转化株在37℃仍可存活并产类胡萝卜素，而野生型MS12不生长。
- 20℃时角黄素和echinenone产量最高，35℃时总类胡萝卜素和β-胡萝卜素产量最高。
- 与之前质粒转化法（角黄素仅6-13 μg/g干重）相比，基因组整合菌株产量显著提高。
- 转化株总类胡萝卜素含量高于未转化菌，提示酮基衍生物可能刺激β-胡萝卜素合成。
研究结论
通过基因组整合细菌crtW基因成功构建了稳定且能高效产生角黄素的Mucor circinelloides工程菌株，优化碳源和温度后角黄素产量可达200 μg/g干重以上，表明该菌株是进一步角黄素生产菌株改良和虾青素生产开发的有前景的宿主。