Characterization of a stereospecific acetoindiacetyl reductase from Rhodococcus erythropolis WZ010 and its application for the synthesis of (2S,3S)-2,3-butanediol
- 作者
- Zhao Wang, Qingqing Song, Meilan Yu, Yifang Wang, Bin Xiong, Yinjun Zhang, Jianyong Zheng, Xiangxian Ying
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2013）
- DOI
- 10.1007/s00253-013-4870-5
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
从红平红球菌WZ010中鉴定并表征一种立体特异性乙偶姻(联乙酰)还原酶(ReADR)，用于合成光学纯的(2S,3S)-2,3-丁二醇，并开发单酶偶联体系实现辅酶原位再生及双手性醇的同步制备。
研究策略
克隆表达红平红球菌WZ010的adr基因，通过Ni亲和层析纯化ReADR，系统表征其生化性质、底物谱、动力学参数和立体选择性，进而构建以二乙酰和1-苯乙醇为底物的偶联氧化还原反应，实现NAD+/NADH的高效循环。
核心内容
从红平红球菌WZ010中克隆表达了adr基因，编码一种NAD⁺依赖的短链脱氢酶ReADR，纯化后比活力为9.16 U/mg。该酶具有绝对(S)-立体选择性，还原活性比氧化活性高11.9倍，对二乙酰的Km为0.44 mM，且在30% DMSO中4小时后仍保留53.6%活性。利用该酶单酶偶联体系，以二乙酰和消旋1-苯乙醇为底物，在1 mM NADH下实现辅酶原位再生，当底物比例为1:5时二乙酰完全转化，(2S,3S)-2,3-丁二醇产率达98%、e.e. 100%，(R)-1-苯乙醇e.e. 97.1%，辅酶总转化数TTN为147.9。该研究首次从红平红球菌中表征乙偶姻还原酶，通过单酶同时催化不对称还原与立体选择性氧化，为光学纯双手性醇的绿色制备提供了经济高效的策略。
创新点
首次从红平红球菌中表征乙偶姻(联乙酰)还原酶；ReADR具有绝对(S)-立体选择性、高DMSO耐受性（30% DMSO下活性保留53.6%）；通过单酶同时催化不对称还原和立体选择性氧化，以极低辅酶浓度（1 mM）高效合成两种手性醇并再生辅酶。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Rhodococcus erythropolis WZ010 | 2,3-丁二醇合成通路 | adr | ReADR | 催化 | 原始菌株，酒精发酵产生(2S,3S)-2,3-丁二醇和(S)-乙偶姻 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | — | adr | ReADR | 催化 | 重组表达宿主，用于异源表达和纯化ReADR |
| — | 2,3-丁二醇代谢 | — | ReADR | 催化 | 催化二乙酰→(S)-乙偶姻→(2S,3S)-2,3-丁二醇，以及(S)-1-苯乙醇氧化为苯乙酮 |
关键发现
- 红平红球菌WZ010在酒精发酵中产生光学纯(S)-乙偶姻和(2S,3S)-2,3-丁二醇（<0.5 mM）。adr基因长780 bp，编码259个氨基酸，亚基分子量26,864，天然为同源二聚体（约70,000）。纯化酶比活力9.16 U/mg（二乙酰还原），纯化4.0倍。最适还原条件为pH
- 0、30°C，最适氧化条件为pH
- 5、25°C；还原活性比氧化活性高11.9倍。底物谱广，氧化2-戊醇活性最高（相对活性257.1%），还原二乙酰活性最高。在30% (v/v) DMSO中4小时后残留活性53.6%。动力学参数：二乙酰的Km=0.44 mM，kcat/Km=4,432 s⁻¹M⁻¹；NADH的Km=0.77 mM，kcat/Km=8,519 s⁻¹M⁻¹；NAD⁺的Km=2.78 mM，kcat/Km=269 s⁻¹M⁻¹；(2S,3S)-2,3-丁二醇的Km=8.82 mM，kcat/Km=61；苯乙酮的Km=11.91 mM，kcat/Km=51。二乙酰还原生成(S)-乙偶姻（产率34%）和(2S,3S)-2,3-丁二醇（产率60%），均光学纯。偶联反应中，60 mM二乙酰与300 mM消旋1-苯乙醇（比例1:5）时，二乙酰完全转化，(2S,3S)-2,3-丁二醇产率98%、e.e. 100%，(R)-1-苯乙醇e.e.
- 1%、转化率49.3%，NADH（1 mM）总转化数TTN为147.9；比例1:2时二乙酰转化率81%，生成46.7% (S)-乙偶姻和22.8% (2S,3S)-2,3-丁二醇，两者e.e. 100%，(R)-1-苯乙醇e.e. 100%；比例1:8时二乙酰转化率100%，(2S,3S)-2,3-丁二醇产率97%、e.e. 100%，(R)-1-苯乙醇e.e.
- 8%。全细胞催化方面，红平红球菌WZ010氧化120 mM 1-苯乙醇得49.4% (R)-1-苯乙醇产率和99.9% e.e.，还原80 mM苯乙酮得64.5% (S)-1-苯乙醇产率。
研究结论
ReADR是一种NAD⁺依赖的短链脱氢酶，具有绝对(S)-立体选择性，在体内偏向催化二乙酰还原生成(2S,3S)-2,3-丁二醇。通过将二乙酰的不对称还原与1-苯乙醇的立体选择性氧化偶联于单酶体系，可高效同时合成(2S,3S)-2,3-丁二醇和(R)-1-苯乙醇，并实现辅酶原位再生，为手性醇的绿色制备提供了经济高效的策略。