Functional analysis of a prenyltransferase gene (paxD) in the paxilline biosynthetic gene cluster
- 作者
- Chengwei Liu, Motoyoshi Noike, Atsushi Minami, Hideaki Oikawa, Tohru Dairi
- 单位
- Graduate School of Engineering, Hokkaido University; Graduate School of Science, Hokkaido University
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2013）
- DOI
- 10.1007/s00253-013-4834-9
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
paxilline 生物合成基因簇中 paxD 基因的功能未知，需要阐明其是否参与 paxilline 的异戊烯基化修饰并解析其酶学特性。
研究策略
从 Penicillium paxilli 中克隆 paxD 基因，在大肠杆菌中过表达并纯化重组 PaxD 蛋白；通过体外酶活测定、LC-MS 和 NMR 鉴定反应产物；检测 P. paxilli 培养液中的体内产物；系统研究酶的底物特异性、金属离子依赖性、最适反应条件及动力学参数。
核心内容
本研究从 Penicillium paxilli 中克隆了 paxilline 生物合成基因簇中的 paxD 基因，在大肠杆菌中异源表达并纯化出重组蛋白 PaxD，通过体外酶活测定和 LC-MS、NMR 分析鉴定了反应产物。结果表明 PaxD 属于真菌 DMATS 家族，催化 DMAPP 连续两次转移到 paxilline 的 C-21 和 C-22 位，生成 21,22-二异戊烯基 paxilline，这种连续二异戊烯基化在真菌异戊烯基转移酶中较为罕见。该酶以同源二聚体形式存在，最适 pH 8.0、温度 37°C，不依赖二价金属离子。动力学参数显示 Km(paxilline) 为 106.4 μM，kcat 为 0.97 s⁻¹，催化效率较低。PaxD 对底物具有严格选择性，仅接受 paxilline 和 DMAPP。在 P. paxilli 培养液中检测到两种异戊烯基化产物，其产量约为 paxilline 的 0.5%，证实这些修饰产物是该基因簇的天然发酵终产物。该发现首次阐明 paxD 的功能，揭示了真菌异戊烯基转移酶催化连续修饰的独特机制，而 PaxD 较低的催化效率也解释了 paxilline 在原始菌株中作为主要积累产物的原因。
创新点
首次证明 PaxD 催化 paxilline 的连续两次异戊烯基化反应生成 21,22-二异戊烯基 paxilline，这种连续二异戊烯基化在真菌 DMATS 家族中罕见；同时证实这些异戊烯基化产物在 P. paxilli 培养液中天然存在，提示 pax 基因簇的最终产物是异戊烯基化 paxilline。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Penicillium paxilli ATCC26601 | paxilline 生物合成 | paxD | PaxD | 催化 | 催化 paxilline 的连续二异戊烯基化，生成 21,22-diprenylated paxilline |
| Escherichia coli M15 | 异源表达 | paxD | PaxD | 催化 | 重组蛋白表达宿主，用于 PaxD 的过表达与纯化 |
关键发现
- PaxD 为同源二聚体（单体约 47 kDa，天然约 105 kDa）；以 paxilline 和 DMAPP 为底物时，产生主要产物 21,22-diprenylated paxilline（HR-ESI-MS [M+H]+ m/z
- 3754，计算值
- 3734）和次要产物 mono-prenylated paxilline；在 P. paxilli 培养液中检测到两种产物，产量约为 paxilline 的
- 5%；PaxD 最适 pH
- 0，最适温度 37°C；不依赖二价金属离子（5 mM EDTA 不影响活性），Co2+、Cu2+、Zn2+ 使活性降至对照的 50% 以下；动力学参数：Km(paxilline)=106.4±5.4 μM，Km(DMAPP)=0.57±0.02 μM，kcat=0.97±0.01 s⁻¹，kcat/Km(paxilline)=9.2 s⁻¹·mM⁻¹；PaxD 只接受 paxilline 为异戊烯基受体、DMAPP 为供体，对其他化合物（色氨酸、吲哚、GGI、环二肽、羟基萘等）无活性。
研究结论
paxD 基因编码一种异戊烯基转移酶，催化 DMAPP 连续转移到 paxilline 的 C-21 和 C-22 位，生成 21,22-二异戊烯基 paxilline。该酶的连续二异戊烯基化活性在真菌异戊烯基转移酶中较为独特，其较低的催化效率可能解释了 P. paxilli 培养液中 paxilline 的积累。异戊烯基化 paxillines 作为天然产物在培养液中被检测到，表明它们是 pax 基因簇的最终发酵产物。