Enhanced production of poly(lactate-co-3-hydroxybutyrate) from xylose in engineered Escherichia coli overexpressing a galactitol transporter
- 作者
- John Masani Nduko, Ken'ichiro Matsumoto, Toshihiko Ooi, Seiichi Taguchi
- 单位
- Division of Biotechnology and Macromolecular Chemistry, Graduate School of Engineering, Hokkaido University, N13-W8, Kita-ku, Sapporo 060-8628, Japan; JST-CREST, K's Gobancho, 7 Gobancho, Chiyoda-ku 102-0076, Tokyo, Japan
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2014）
- DOI
- 10.1007/s00253-013-5401-0
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
以木糖为底物在工程大肠杆菌中提高乳酸基共聚物聚(乳酸-co-3-羟基丁酸酯)[P(LA-co-3HB)]的生产率和乳酸(LA)单元比例，解决LA富集型（>50 mol%）共聚物产量低的问题。
研究策略
采用两种代谢工程策略：(1) 敲除与乳酸生产竞争的途径基因（ΔpflA、Δpta、ΔackA、ΔpoxB、Δdld及ΔpflA+Δdld双突变），将碳通量重导向乳酸；(2) 过表达ATP非依赖性的半乳糖醇转运蛋白GatC，增强木糖摄取和利用。
核心内容
该研究在木糖为底物的工程大肠杆菌中，通过敲除乳酸竞争途径基因并过表达半乳糖醇转运蛋白GatC，提升了乳酸基共聚物P(LA-co-3HB)的生产率和乳酸单元比例。作者分别单敲除pflA、pta、ackA、poxB和dld基因，其中ΔpflA、Δpta和Δdld单敲除菌株在20 g/L木糖下将乳酸比例提升至60、58和66 mol%，高于对照菌株的56 mol%。进一步将ΔpflA与Δdld双突变，使乳酸比例达到73 mol%。过表达GatC后，ΔpflA+gatC菌株产量达8.3 g/L，为理论最大产量的72%；而BW25113(pCA24NgatC)在40 g/L木糖下获得14.4 g/L的最高生产率，乳酸比例为66 mol%；ΔpflA+Δdld在30 g/L木糖下合成6.4 g/L聚合物且保持73 mol%的最高乳酸比例。所获聚合物重均分子量在34,000–114,000范围内。该研究首次将竞争途径敲除与GatC过表达结合，有效解决了高乳酸比例共聚物产量低的瓶颈，为利用木质纤维素木糖合成乳酸富集型生物塑料提供了高效平台。
创新点
首次将竞争途径基因敲除与GatC过表达相结合，利用木糖高效合成LA比例超过70 mol%的P(LA-co-3HB)；获得迄今最高的P(LA-co-3HB)生产率14.4 g/L。
研究对象（11）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BW25113 | 木糖转运 | gatC | GatC（半乳糖醇转运蛋白） | 转运 | ATP非依赖性木糖转运蛋白，过表达提高木糖摄取和聚合物产量 |
| Escherichia coli BW25113 | P(LA-co-3HB)生物合成 | pct | 丙酰辅酶A转移酶（PCT） | 催化 | 将乳酸转化为乳酰辅酶A，参与LA单元掺入聚合物 |
| Escherichia coli BW25113 | P(LA-co-3HB)生物合成 | phaC1Ps(ST/FS/QK) | 乳酸聚合酶（LPE） | 催化 | 进化的乳酸聚合酶，催化LA-CoA与3HB-CoA共聚生成P(LA-co-3HB) |
| Escherichia coli BW25113 | P(LA-co-3HB)生物合成 | phaA | β-酮硫解酶（PhaA） | 催化 | 催化两分子乙酰辅酶A缩合为乙酰乙酰辅酶A |
| Escherichia coli BW25113 | P(LA-co-3HB)生物合成 | phaB | NADPH依赖性乙酰乙酰辅酶A还原酶（PhaB） | 催化 | 将乙酰乙酰辅酶A还原为3-羟基丁酰辅酶A，提供3HB单元 |
| Escherichia coli BW25113 | 丙酮酸甲酸裂解途径 | pflA | 丙酮酸甲酸裂解酶激活酶（PflA） | 催化 | 敲除后消除甲酸生成，将碳通量导向乳酸；与Δdld协同提高LA比例 |
| Escherichia coli BW25113 | 乙酸合成途径 | pta | 磷酸转乙酰酶（Pta） | 催化 | 敲除减少乙酸生成，增强乳酸积累和聚合物产量 |
| Escherichia coli BW25113 | 乙酸合成途径 | ackA | 乙酸激酶（AckA） | 催化 | 敲除消除乙酸生成，提高乳酸碳通量 |
| Escherichia coli BW25113 | 丙酮酸氧化途径 | poxB | 丙酮酸氧化酶（PoxB） | 催化 | 敲除对聚合物生产不利，可能因其在生长效率中起重要作用 |
| Escherichia coli BW25113 | 乳酸氧化途径 | dld | NAD+非依赖性乳酸脱氢酶（Dld） | 催化 | 敲除阻止乳酸再利用，与ΔpflA双敲除使LA比例达73 mol% |
| Escherichia coli BW25113 | 乳酸合成途径 | ldhA | 乳酸脱氢酶（LdhA） | 催化 | 内源酶，催化丙酮酸生成乳酸，为LA单元提供前体（图1中提及） |
关键发现
- 在20 g/L木糖下，ΔpflA、Δpta和Δdld单敲除菌株的LA比例分别提高至60、58和66 mol%（BW25113为56 mol%）
- ΔpflA+Δdld双突变菌株LA比例达73 mol%。GatC过表达进一步提高产量和LA比例：ΔpflA+gatC菌株产量达8.3 g/L，为理论最大产量的72%
- BW25113(pCA24NgatC)在40 g/L木糖下取得最高生产率14.4 g/L，LA比例为66 mol%
- ΔpflA+Δdld菌株在30 g/L木糖下合成6.4 g/L P(LA-co-3HB)，同时保持最高LA比例73 mol%。此外，聚合物重均分子量（Mw）范围为34,000–114,000。
研究结论
敲除竞争性代谢途径（特别是ΔpflA+Δdld）和过表达GatC可协同提高木糖来源P(LA-co-3HB)的生产率和LA比例，为高效利用木质纤维素生物质中的木糖合成LA富集型生物塑料提供了有效平台。