Metabolic pathway optimization using ribosome binding site variants and combinatorial gene assembly
- 作者
- Farnaz F Nowroozi, Edward E. K. Baidoo, Simon Ermakov, Alyssa M. Redding-Johanson, Tanveer S. Batth, Christopher J. Petzold, Jay D. Keasling
- 单位
- Department of Bioengineering, University of California, Berkeley, CA 94720, USA; Joint Bioenergy Institute, 5885 Hollis Avenue, Fourth Floor, Emeryville, CA 94608, USA; Physical Biosciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, CA 94720, USA; Department of Molecular Cell Biology, University of California, Berkeley, CA 94720, USA; Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of California, Berkeley, CA 94720, USA
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2013）
- DOI
- 10.1007/s00253-013-5361-4
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
异源甲羟戊酸途径在大肠杆菌中表达不平衡，导致中间产物（如甲羟戊酸、FPP）积累、生长受抑和青蒿二烯产量低，而难以选择合适的RBS来优化翻译效率。
研究策略
利用理论强度不同的RBS变体，通过BioBrick组装构建包含甲羟戊酸途径下游基因（mevK、pmk、pmd、idi、ispA）和ads的操纵子，系统比较不同RBS组合对生长、青蒿二烯产量、酶水平和中间代谢物积累的影响，并通过增加碳源浓度进一步优化。
核心内容
本研究针对大肠杆菌中异源甲羟戊酸途径表达不平衡导致中间产物积累、生长受抑和青蒿二烯产量低的问题，系统引入理论强度不同的核糖体结合位点（RBS）变体，通过BioBrick组装将下游基因mevK、pmk、pmd、idi、ispA及ads构建为组合操纵子，比较不同RBS组合对生长、酶水平、中间代谢物及产物产量的影响，并结合靶向蛋白质组学和LC-MS代谢物分析进行优化。结果显示，携带全部中等强度RBS的菌株在3%甘油条件下青蒿二烯产量最高达3.6 g/L，较1%甘油时提高约5倍；特定RBS使ADS蛋白水平提高2倍，MK蛋白水平提高3至10倍。研究还确定了法尼基焦磷酸（FPP）的毒性阈值约为1 μM，超过200 nM即显著抑制生长，而无ADS的菌株FPP积累最高接近1 μM。该工作表明，平衡途径通量比单纯提高酶量更为关键，组合RBS装配联合组学分析是减少毒性中间体积累、提升异戊二烯类化合物产量的有效策略。
创新点
将组合RBS装配策略系统应用于甲羟戊酸途径下游基因和ADS，结合靶向蛋白质组学和LC-MS代谢物分析，确定了FPP的毒性阈值（约1 μM），并证明平衡途径通量比单纯提高酶量更为关键。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径（mevalonate pathway） | mevK | 甲羟戊酸激酶 (MK) | 催化 | 催化甲羟戊酸生成甲羟戊酸-5-磷酸，其表达水平影响下游通量 |
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径（mevalonate pathway） | pmk | 磷酸甲羟戊酸激酶 (PMK) | 催化 | 催化甲羟戊酸-5-磷酸生成甲羟戊酸-5-二磷酸，低表达是途径瓶颈之一 |
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径（mevalonate pathway） | pmd | 甲羟戊酸二磷酸脱羧酶 (PMD) | 催化 | 催化甲羟戊酸-5-二磷酸生成异戊烯基焦磷酸（IPP） |
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径（mevalonate pathway） | idi | 异戊烯基焦磷酸异构酶 (IDI) | 催化 | 催化IPP与DMAPP互变，大肠杆菌内源基因 |
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径（mevalonate pathway） | ispA | 法尼基焦磷酸合酶 (IspA) | 催化 | 催化IPP和DMAPP缩合生成FPP，大肠杆菌内源基因 |
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径（mevalonate pathway） | ads | 青蒿二烯合酶 (ADS) | 催化 | 催化FPP环化生成青蒿二烯，其表达水平影响FPP消耗和产物积累 |
关键发现
- 通过组合RBS优化，在3%甘油下携带全部中等强度RBS的pTrc-M.ADS-MBIS1菌株青蒿二烯产量最高达3.6 g/L，比1%甘油时提高约5倍
- H.2 RBS使ADS蛋白水平提高2倍
- MBIS2中MK蛋白水平比MBIS1提高3-10倍
- 大肠杆菌可耐受约1 μM FPP，超过200 nM即抑制生长，MBIS1菌株FPP最高约200 nM，MBIS2最高约700 nM，无ADS的MBIS2最高约1 μM
- 1%甘油下MBIS1产量860 mg/L，H.1 RBS产量520 mg/L
- 3%甘油下M.ADS-MBIS1特异性产量比1%时提高约3倍。
研究结论
在大肠杆菌中优化异源甲羟戊酸途径表明，平衡途径通量和维持稳定生长是优化异戊二烯类化合物生产的关键；组合RBS装配结合蛋白质组学和代谢物分析是一种有效的途径优化方法，可减少毒性中间体积累并提高产物产量。