高级醇 · 代谢工程文献库

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Enhanced butanol production in Clostridium acetobutylicum ATCC 824 by double overexpression of 6-phosphofructokinase and pyruvate kinase genes

作者
Jey- R S. Ventura, Hui Hu, Deokjin Jahng
杂志
Applied Microbiology and Biotechnology（2013）
DOI
10.1007/s00253-013-5075-7
所属领域
代谢工程
关键词
6-phosphofructokinaseATPClostridium acetobutylicumNADHPyruvate kinase
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解决的核心问题

丙酮丁醇梭菌丁醇发酵产量低，糖酵解途径关键酶对丁醇合成的调控作用尚未明确。

研究策略

过表达6-磷酸果糖激酶基因（pfkA）和丙酮酸激酶基因（pykA），增强ATP和NADH供给，提高丁醇耐受性，从而提升丁醇产量。

研究路线图

100%
研究问题：丙酮丁醇梭菌丁醇产量低，糖酵解酶调控机制不明
策略：双过表达pfkA与pykA基因
关键改造：构建共表达载体，电转化C. acetobutylicum ATCC 824
结果1：批式发酵丁醇13.07 g/L，乙醇2.17 g/L（+29.4%/+85.5%）
结果2：补料分批发酵丁醇19.12 g/L，总溶剂28.02 g/L（+30.7%）
结果3：ATP和NADH水平显著提高（24-72h）
结果4：丁醇耐受性增强（1.5% v/v胁迫下生长速率提升）
结论：增强糖酵解辅因子供给与丁醇耐受性，促进丁醇合成
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核心内容

该研究在丙酮丁醇梭菌ATCC 824中同时过表达糖酵解途径关键酶基因6-磷酸果糖激酶（pfkA）和丙酮酸激酶（pykA），旨在增强ATP和NADH供给并提升菌株丁醇耐受性，从而突破丁醇产量瓶颈。批式发酵中，双过表达菌株的丁醇和乙醇产量分别达到13.07 g/L和2.17 g/L，较野生型提高29.4%和85.5%；补料分批发酵中丁醇浓度进一步升至19.12 g/L，总溶剂达28.02 g/L，丁醇较野生型提高30.7%。胞内代谢物分析显示，双过表达菌株在发酵24至72小时期间ATP和NADH水平始终高于野生型，且其在1.5%丁醇胁迫下的最大比生长速率显著优于野生型，证实丁醇耐受性增强。结果表明，强化糖酵解途径的辅因子供给能有效驱动丁醇和乙醇合成，同时提升菌株对产物的耐受能力，为梭菌发酵生产丁醇提供了基于中心碳代谢工程的可行策略。

创新点

首次在C. acetobutylicum ATCC 824中同时过表达pfkA和pykA基因，通过增强糖酵解途径的辅因子供给显著提高丁醇和乙醇产量，并增强菌株对丁醇的耐受性。

研究对象（2）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Clostridium acetobutylicum ATCC 824 糖酵解（EMP途径） pfkA 6-磷酸果糖激酶（PFK） 催化 过表达该基因增强糖酵解通量，提高ATP和NADH水平
Clostridium acetobutylicum ATCC 824 糖酵解（EMP途径） pykA 丙酮酸激酶（PYK） 催化 过表达该基因增强糖酵解通量，提高ATP和NADH水平

关键发现

  1. 双过表达菌株ATCC 824/pfkA+pykA在批式发酵中丁醇和乙醇浓度分别达13.07 g/L和2.17 g/L，较野生型提高29.4%和85.5%
  2. 补料分批发酵中丁醇和总溶剂浓度分别达19.12 g/L和28.02 g/L，其中丁醇浓度较野生型补料分批（13.25 g/L）提高30.7%
  3. 双过表达菌株的胞内ATP和NADH浓度在24-72 h内均高于野生型
  4. 在1.5%（v/v）丁醇胁迫下，双过表达菌株的最大比生长速率显著高于野生型，表明丁醇耐受性增强。

研究结论

过表达pfkA和pykA通过提高ATP和NADH水平并增强丁醇耐受性，显著促进C. acetobutylicum ATCC 824的丁醇和乙醇合成，为通过糖酵解途径工程提高丁醇产量提供了新策略。