高级醇 · 代谢工程文献库

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Functional assembly of camphor converting two-component Baeyer-Villiger monooxygenases with a flavin reductase from E. coli

作者
Maria Kadow, Kathleen Balke, Andrew Willetts, Uwe T. Bornscheuer, J.-E. Backvall
单位
Department of Organic Chemistry, Arrhenius Laboratory, Stockholm University; Institute of Biochemistry, Department of Biotechnology & Enzyme Catalysis, Greifswald University; Curnow Consultancies
杂志
Applied Microbiology and Biotechnology（2013）
DOI
10.1007/s00253-013-5338-3
所属领域
酶工程与生物催化
关键词
Baeyer-Villiger monooxygenasesFlavin reductaseFreFusion proteinMulti-component flavin-dependent monooxygenasesPseudomonas putida NCIMB 10007
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解决的核心问题

双组分Baeyer-Villiger单加氧酶（type II BVMO）在合成应用中受限，主要问题是缺乏有效的还原型FMN供给者，需要鉴定并组装合适的黄素还原酶以促进其生物氧化活性。

研究策略

通过序列同源比对从E. coli基因组中鉴定黄素还原酶Fre，将Fre与2,5-或3,6-二酮樟脑单加氧酶（DKCMO）在大肠杆菌中共表达，并利用NADH再生系统（全细胞或甲酸脱氢酶）实现樟脑和降樟脑的高效转化；同时尝试构建Fre与DKCMO的融合蛋白。

研究路线图

100%
研究问题：双组分BVMO缺乏FMN供给者，催化效率低
策略：鉴定E. coli黄素还原酶Fre，与DKCMO共表达并构建融合蛋白
关键改造：Fre与2,5-/3,6-DKCMO共表达于E. coli BL21(DE3)
关键改造：构建7种Fre-DKCMO融合蛋白
结果：共表达显著提高樟脑转化（96% vs 74%）
结果：纯酶加Fre后转化率>99%，无Fre仅4%
结果：融合蛋白保留FMN还原活性但氧化活性很差
结论：Fre是DKCMO有效伴侣，共表达+NADH再生为最佳策略，融合蛋白不适用
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核心内容

本研究针对双组分Baeyer-Villiger单加氧酶（type II BVMO）因缺乏还原型FMN供给者而限制其合成应用的问题，从大肠杆菌基因组中鉴定出黄素还原酶Fre，并将其与来自恶臭假单胞菌的2,5-或3,6-二酮樟脑单加氧酶（DKCMO）在大肠杆菌中共表达，同时借助全细胞或甲酸脱氢酶构成NADH再生系统，实现樟脑和降樟脑的高效转化。结果显示，2,5-DKCMO与Fre共表达时(+)-樟脑1.5小时转化率达96%，而单独表达2,5-DKCMO时4小时仅为74%；3,6-DKCMO共表达时(-)-樟脑1.5小时转化率为77%，对照仅14%。纯酶体系中加入Fre后，两类DKCMO对相应樟脑底物的转化率均超过99%，而无Fre时产物仅约4%。此外，虽然构建的7种Fre-DKCMO融合蛋白均保留FMN还原活性，但樟脑氧化活性很低，最佳融合蛋白对(-)-樟脑仅15%转化，说明融合策略因蛋白不稳定及加氧活性受损而不适用。该工作证明跨物种黄素还原酶Fre可有效支持DKCMO催化，共表达结合辅因子再生是提升双组分BVMO实用性的可行策略。

创新点

首次鉴定E. coli的Fre可作为双组分BVMO的有效还原型FMN供给者；证明跨物种的黄素还原酶能支持DKCMO催化；系统比较共表达与融合蛋白策略，发现融合蛋白不稳定且氧化活性差。

研究对象（4）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
E. coli BL21(DE3) 樟脑降解/双组分Baeyer-Villiger氧化 fre Fre 催化 黄素还原酶，催化NAD(P)H还原FMN，为DKCMO提供还原型FMN
Pseudomonas putida NCIMB 10007 樟脑降解 2,5-DKCMO 2,5-DKCMO 催化 双组分Baeyer-Villiger单加氧酶，催化(+)-樟脑及其衍生物的氧化
Pseudomonas putida NCIMB 10007 樟脑降解 3,6-DKCMO 3,6-DKCMO 催化 双组分Baeyer-Villiger单加氧酶，催化(-)-樟脑及其衍生物的氧化
Candida boidinii 辅因子再生 fdh 甲酸脱氢酶 能量供给 利用甲酸再生NADH，为DKCMO/Fre系统提供还原力

关键发现

  1. 2,5-DKCMO与Fre共表达时，(+)-樟脑1.5h转化率达96%（仅2,5-DKCMO时4h为74%）；降樟脑4h转化率39%（对照18%）；3,6-DKCMO与Fre共表达时，(-)-樟脑1.5h转化率77%（对照14%）。纯酶体系中，加入Fre后2,5-DKCMO对(+)-樟脑4h转化率>99%，3,6-DKCMO对(-)-樟脑1.5h转化率>99%；无Fre时仅4%产物。纯酶加Fre时降樟脑转化率分别为69%（2,5-DKCMO）和32%（3,6-DKCMO）。构建的7种融合蛋白均保留FMN还原活性（Vmax
  2. 1-0.34 U/mg，KM
  3. 4-19.1 μM），但樟脑氧化活性很低，最佳融合蛋白B对(-)-樟脑仅15%转化。

研究结论

E. coli来源的Fre是DKCMO的有效FMN还原酶伴侣，共表达结合NADH再生系统（如全细胞或FDH）可显著提高双组分BVMO的催化效率；而Fre-DKCMO融合蛋白因不稳定及加氧活性受损不适于应用，分开表达并辅以辅因子再生是更实用的策略。