Genetic engineering of the complete carotenoid pathway towards enhanced astaxanthin formation in Xanthophyllomyces dendrorhous starting from a high-yield mutant
- 作者
- Sören Gassel, Jürgen Breitenbach, Gerhard Sandmann
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2013）
- DOI
- 10.1007/s00253-013-5358-z
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
野生型和经典突变体Xanthophyllomyces dendrorhous的虾青素产量仍太低，不足以支撑有吸引力的生物工艺过程，需要进一步提高虾青素积累量。
研究策略
将经典诱变与完整类胡萝卜素途径的基因工程相结合：从两个高产虾青素突变体出发，逐步过表达限速酶（HMG-CoA还原酶、牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶、八氢番茄红素合酶/番茄红素环化酶、虾青素合酶），以增强类胡萝卜素合成的前体供应、提高代谢物流入途径并高效转化中间产物为虾青素。
核心内容
该研究以Xanthophyllomyces dendrorhous高产虾青素突变体为起点，将经典诱变与完整类胡萝卜素途径的基因工程相结合，旨在突破虾青素产量瓶颈。研究者构建了三个可连续整合的转化质粒系统，每个质粒携带两个基因盒，逐步过表达限速酶HMG-CoA还原酶、牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶、八氢番茄红素合酶/番茄红素环化酶及虾青素合酶，以增强前体供给并推动代谢流高效转化为虾青素。起始突变体AXG-13和AXJ-20的虾青素含量已比野生型高15倍；经三步连续转化后，最佳菌株AXJ#37284的虾青素含量达8.7 mg/g干重，接近9 mg/g，且虾青素占总类胡萝卜素比例从双转化子的52%和61%分别提升至64%和69%。在优化发酵条件下，产量预计可再提高3倍，与商业生产菌株Haematococcus pluvialis相当。结果表明，经典诱变结合系统途径工程能高效获得迄今实验室培养最高水平的虾青素积累菌株，具备商业化开发潜力。
创新点
构建了新的转化质粒pPR2TNH和pPR2TNN（分别以潮霉素和诺尔丝菌素抗性为筛选标记），与已有的pPR2TN（G418抗性）形成三个可连续整合的载体系统，每个质粒可插入两个基因盒，允许逐步整合多达六个基因；首次对X. dendrorhous高产突变体进行完整类胡萝卜素途径的逐步基因工程改造，最终获得接近9 mg/g干重的虾青素含量。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Xanthophyllomyces dendrorhous | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtYB | 八氢番茄红素合酶/番茄红素环化酶（CrtYB） | 催化 | 双功能酶，催化八氢番茄红素合成及番茄红素环化，为类胡萝卜素途径的限速步骤。 |
| Xanthophyllomyces dendrorhous | 类胡萝卜素生物合成途径 | asy | 虾青素合酶（Asy） | 催化 | 催化β-胡萝卜素及其羟基/酮基中间产物转化为虾青素的多步氧化反应。 |
| Xanthophyllomyces dendrorhous | 甲羟戊酸途径 / 类胡萝卜素前体供给 | crtE | 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶（CrtE） | 催化 | 催化生成牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（GGPP），为类胡萝卜素合成提供前体。 |
| Xanthophyllomyces dendrorhous | 甲羟戊酸途径 | HMG | 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMG-CoA还原酶） | 催化 | 以截短形式（缺乏膜结合区）过表达，增强甲羟戊酸途径代谢流，为类胡萝卜素合成提供充足前体。 |
关键发现
- 起始的两个突变体AXG-13和AXJ-20的虾青素含量比野生型高15倍。第一步转化（共表达crtYB和asy）后，最佳转化子AGX#5和AXJ#37的虾青素含量分别为3.1 mg/g dw和3.7 mg/g dw
- 第二步转化（共表达HMG和crtE）后，AGX#521和AGX#522达5.2 mg/g dw，AXJ#3726达4.7 mg/g dw，AXJ#3728达5.8 mg/g dw
- 第三步额外整合asy后，AXG#5221达8.0 mg/g dw，AXG#5223达6.5 mg/g dw，AXJ#37284达8.7 mg/g dw，AXJ#37287达7.8 mg/g dw，最高值接近9 mg/g dw。在最终转化子中，虾青素占总类胡萝卜素的比例从双转化子的52%和61%分别提高到64%和69%。在优化发酵条件下，产量预计可比摇瓶培养再提高3倍，与商业生产天然虾青素的Haematococcus pluvialis相当。
研究结论
经典诱变与系统途径工程相结合能高效获得极高虾青素积累的X. dendrorhous菌株，其虾青素产量达到迄今实验室培养的最高水平，并具有商业化开发潜力；在优化发酵条件下有望建立具有成本竞争力的生物工艺。