Selection of an Effective Red-Pigment Producing Monascus pilosus by Efficient Transformation with Aurintricarboxylic Acid
- 作者
- Yi-Pei CHEN, I-Ching CHEN, Ing-Er HWANG, Gwo-Fang YUAN, Li-Ling LIAW, Ching-Ping TSENG
- 单位
- Department of Biological Science and Technology, National Chiao Tung University; Bioresource Collection and Research Center, Food Industry Research and Development Institute
- 杂志
- Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry（2008）
- DOI
- 10.1271/bbb.80342
- 所属领域
- 代谢工程 / 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
红曲霉（Monascus pilosus）遗传转化效率低，难以通过随机突变筛选高产红色素菌株。
研究策略
利用核酸酶抑制剂金精三羧酸（ATA）预处理红曲霉原生质体，结合PEG-CaCl2介导的转化，提高随机突变频率，并筛选高产红色素转化株。
核心内容
针对红曲霉遗传转化效率低、难以筛选高产红色素菌株的问题，本研究首次将核酸酶抑制剂金精三羧酸（ATA）引入Monascus pilosus的转化体系。通过用ATA预处理原生质体并结合PEG-CaCl2介导的转化，极大提升了随机突变频率。结果显示，1.0 mM ATA处理下的转化效率达到159±24个转化子/5 μg线性质粒，较非REMI组（17±2）提高9.4倍，也优于FspI-REMI（48±4）和HpaI-REMI（119±11）等传统限制酶介导整合方法。体外实验证实ATA能有效保护质粒免受核酸酶降解，在3.5 mg/mL蛋白裂解液中1.0 mM ATA显著延长质粒稳定性。利用该方法筛选获得的T7转化株红色素产量比野生型提高4至5倍，且菌体生物量无显著差异，同时其达到最大红色素产量的时间由野生型的第10天提前至第8天。该策略操作简便、无需筛选多种限制酶，为红曲霉及聚酮类次级代谢产物的高产菌株选育提供了高效可行的手段。
创新点
首次在红曲霉中应用ATA促进遗传转化，无需测试不同限制酶，操作简便；获得红色素产量显著提高的稳定突变株。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Monascus pilosus BCRC38072 | 红色素生物合成（聚酮类） | hsp90 promoter | — | 调控 | 用于驱动HPH-EGFP融合基因表达，增强转化子抗性蛋白产量 |
| Monascus pilosus BCRC38072 | 红色素生物合成（聚酮类） | hph | 潮霉素B磷酸转移酶 | 催化 | 作为抗性筛选标记，与EGFP融合表达 |
关键发现
- ATA处理（1.0 mM）的转化效率为159±24个转化子/5μg线性质粒，较非REMI（17±2）提高9.4倍，较FspI-REMI（48±4）提高3.3倍，较HpaI-REMI（119±11）提高1.3倍
- 1 mM ATA可保护质粒在1 mg/mL蛋白裂解液中的稳定性，1.0 mM ATA在3.5 mg/mL蛋白裂解液中显著延长质粒稳定性
- 筛选出的T7转化株红色素产量比野生型高4-5倍，且细胞量无显著差异
- T7转化株在第8天达到最大红色素产量，野生型在第10天达到最大。
研究结论
ATA可作为有效的核酸酶抑制剂应用于红曲霉的遗传转化，提高转化效率并筛选出高产红色素的稳定突变株，该方法可推广至其他聚酮类次级代谢产物的高产菌株筛选。