A promiscuous prenyltransferase from Aspergillus oryzae catalyses C-prenylations of hydroxynaphthalenes in the presence of different prenyl donors
- 作者
- Daniel Pockrandt, Christopher Sack, Tatjana Kosiol, Shu-Ming Li
- 单位
- Institut fur Pharmazeutische Biologie und Biotechnologie, Philipps-Universitat Marburg, Deutschhausstrasse 17A, 35037 Marburg, Germany
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2014）
- DOI
- 10.1007/s00253-014-5509-x
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
探索DMATS超家族中新的异戊烯基转移酶BAE61387是否能够利用多种异戊烯基供体（DMAPP、GPP和FPP）催化羟基萘的C-异戊烯基化反应，以扩展该酶家族的底物谱和供体谱。
研究策略
从米曲霉DSM1147中克隆候选基因AO090102000322，在大肠杆菌中异源表达并纯化重组蛋白BAE61387-His6，通过体外酶活测定、HPLC产物分析、NMR和MS结构鉴定以及动力学参数表征其催化功能。
核心内容
该研究从米曲霉DSM1147中克隆了编码假定异戊烯基转移酶的基因AO090102000322，在大肠杆菌中异源表达并纯化了重组蛋白BAE61387-His6，蛋白产量为9.0 mg/L。体外酶活实验表明，该酶属于DMATS超家族，天然状态为同源二聚体（93.5 kDa），单体分子量约50.5 kDa。研究发现，BAE61387可接受DMAPP、GPP和FPP三种不同长度的异戊烯基供体，在DMAPP存在时催化10种羟基萘中的7种发生C-异戊烯基化；GPP和FPP分别对应7种和5种底物被接受。以1,7-二羟基萘为底物时，DMAPP、GPP和FPP供体下的转化率分别为72%、46%和18%；动力学参数显示，DMAPP为供体时该底物的Km为0.56 mM，kcat为0.03 s⁻¹。这是首次报道DMATS家族成员能够同时利用三种异戊烯基供体，且对羟基萘底物表现出区域选择性，填补了该家族对FPP供体接受性的空白，展示了其在结构修饰和化学酶法合成中的潜力。
创新点
首次发现DMATS超家族中一个芳香族异戊烯基转移酶同时接受DMAPP、GPP和FPP作为异戊烯基供体，且对羟基萘底物表现出区域选择性C-异戊烯基化，填补了该家族对FPP底物接受性的空白。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 大肠杆菌XL1 Blue MRF' | 异戊烯基转移 | AO090102000322 | BAE61387 | 催化 | 用于异源表达重组BAE61387-His6 |
| 米曲霉DSM1147 | 次生代谢物生物合成 | AO090102000322 | BAE61387 | 催化 | 基因来源菌株，其基因组中的候选基因编码该酶 |
关键发现
- BAE61387可催化10种羟基萘中的7种进行C-异戊烯基化（DMAPP为供体时）
- 用GPP和FPP时分别有7种和5种底物被接受。对1-萘酚、1,7-二羟基萘和2,7-二羟基萘，DMAPP供体下转化率分别为51%、72%和20%
- GPP供体下为15%、46%和29%
- FPP供体下为5%、18%和10%。动力学参数：以DMAPP为供体时，1,7-二羟基萘的Km=0.56 mM，kcat=0.03 s^-1
- DMAPP、GPP、FPP作为供体时（以2a为底物）Km分别为1.28、1.77、1.03 mM。重组蛋白单体分子量约50.5 kDa，天然状态为同源二聚体（93.5 kDa），蛋白产量9.0 mg/L。
研究结论
BAE61387是DMATS超家族中第一个能利用DMAPP、GPP和FPP三种异戊烯基供体的芳香族异戊烯基转移酶，其催化的羟基萘C-异戊烯基化具有区域选择性，展示了该酶在结构修饰和化学酶法合成中的应用潜力。