Isopropanol production with engineered Cupriavidus necator as bioproduction platform
- 作者
- Estelle Grousseau, Jingnan Lu, Nathalie Gorret, Stéphane E. Guillouet, Anthony J. Sinskey
- 单位
- Universite de Toulouse, INSA, UPS, INP; LISBP; INRA, UMR792 Ingenierie des Systemes Biologiques et des Procedes; CNRS, UMR5504; Department of Chemistry, Massachusetts Institute of Technology; Department of Biology, Massachusetts Institute of Technology; Division of Health Sciences and Technology, Massachusetts Institute of Technology; Engineering Systems Division, Massachusetts Institute of Technology
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2014）
- DOI
- 10.1007/s00253-014-5591-0
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
利用Cupriavidus necator作为生物生产平台，通过理性设计异丙醇合成途径，将P(3HB)合成前体流向异丙醇，实现从可再生碳源生产异丙醇。
研究策略
删除phaB1B2B3和phaC1阻断P(3HB)合成，在质粒上共表达phaA、ctfAB以及密码子优化的Clostridium adc和adh，并通过优化密码子、基因拷贝数、基因排列位置和启动子（组成型P_LAC、P_TAC和诱导型P_BAD）来提高异丙醇产量。
核心内容
本研究以 Cupriavidus necator Re2133 为底盘，通过删除 phaB1B2B3 和 phaC1 阻断聚羟基丁酸酯合成，并在质粒上共表达 phaA、ctfAB 及密码子优化的梭菌 adc 和 adh 基因，构建了异丙醇合成途径。针对梭菌基因与宿主 GC 含量差异导致的低表达问题，密码子优化使 ADC 和 ADH 活性分别从 0.75 和 0.05 U/mg 提升至 8.89 和 0.72 U/mg，异丙醇产量提高 8.9 倍。通过比较组成型启动子 P_LAC、P_TAC 和诱导型 P_BAD，发现 P_BAD 诱导后产量较 P_LAC 提高 1.76 倍，并实现了细胞生长与产物生成的解偶联。最终，最优菌株 Re2133/pEG7c 在以果糖为唯一碳源的分批培养中，异丙醇产量达 3.44 g/L，最大比生产速率达理论值的 62%，产率达理论值的 64%，且总体产率和比生产速率均高于文献报道的其他工程菌株。该工作首次在 Cupriavidus necator 中实现异丙醇异源生产，证明其低生物量下高效合成的潜力，为规模化利用可再生碳源生产异丙醇提供了可行平台。
创新点
['首次在Cupriavidus necator中实现异丙醇的异源生产', '通过密码子优化克服梭菌基因与宿主GC含量差异导致的低表达问题', '采用P_BAD诱导型启动子，实现细胞生长与产物生成解偶联']
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Cupriavidus necator Re2133 | P(3HB)合成途径 | phaB1B2B3, phaC1 | 乙酰乙酰辅酶A还原酶、PHA合酶 | 催化 | 被敲除以阻断P(3HB)合成，使碳流转向异丙醇 |
| Cupriavidus necator Re2133 | 异丙醇合成途径 | phaA (H16_A1438) | β-酮硫解酶 | 催化 | 内源基因，质粒上过表达，催化两分子乙酰-CoA缩合为乙酰乙酰-CoA |
| Cupriavidus necator Re2133 | 异丙醇合成途径 | ctfAB (H16_A1331, H16_A1332) | CoA转移酶 | 催化 | 内源基因，质粒上表达，将乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸 |
| Cupriavidus necator Re2133 | 异丙醇合成途径 | adc (CA_P0165) | 乙酰乙酸脱羧酶 | 催化 | 来自Clostridium acetobutylicum，经密码子优化，将乙酰乙酸脱羧为丙酮 |
| Cupriavidus necator Re2133 | 异丙醇合成途径 | adh (AF157307) | 醇脱氢酶 | 催化 | 来自Clostridium beijerinckii，经密码子优化，将丙酮还原为异丙醇 |
| Cupriavidus necator Re2133 | 异丙醇合成途径 | adh (H16_A0757) | 醇脱氢酶 | 催化 | C. necator内源ADH，对丙酮还原活性低，不适合异丙醇生产 |
| Cupriavidus necator Re2133 | 异丙醇合成途径 | P_LAC, P_TAC, P_BAD | — | 调控 | 启动子：P_LAC和P_TAC为组成型，P_BAD为L-阿拉伯糖诱导型，用于差异调控异丙醇途径基因表达 |
关键发现
['Re2133/pEG7c菌株在分批培养中以果糖为唯一碳源，异丙醇产量达3.44±0.14 g/L，生物量仅0.82±0.02 g/L', '最大比生产速率为0.093±0.004 g/g/h，达到理论最大比生产速率（0.15 g/g/h）的62%', '最大异丙醇产率为0.32 Cmol/Cmol，为理论产率（0.5 Cmol/Cmol）的64%', '总体异丙醇产率为0.24±0.01 Cmol/Cmol，总体比生产速率为0.044±0.006 g/g/h，均高于文献报道的其他异丙醇工程菌株', '密码子优化使ADC活性由0.75±0.84 U/mg提高到8.89±1.30 U/mg，ADH活性由0.05±0.01 U/mg提高到0.72±0.04 U/mg，异丙醇产量提高8.9倍', 'P_TAC启动子相比P_LAC使异丙醇产量提高1.16±0.12倍，而P_BAD诱导后产量比P_LAC提高1.76±0.18倍']
研究结论
Cupriavidus necator Re2133/pEG7c是良好的异丙醇生产菌株，在低生物量条件下即可实现高效生产，其内在性能（比产率和产率）超过理论值的60%，具有规模化和多种碳源利用的潜力。