高级醇 · 代谢工程文献库

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Genetic engineering of the green alga Chlorella zofingiensis: a modified norfluazon-resistant phytoene desaturase gene as a dominant selectable marker

作者
Jin Liu, Zheng Sun, Henri Gerken, Junchao Huang, Yue Jiang, Feng Chen
单位
Institute for Food & Bioresource Engineering, College of Engineering, Peking University; Institute of Marine and Environmental Technology, University of Maryland Center for Environmental Science; College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University; Department of Applied Sciences and Mathematics, Arizona State University; Kunming Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences; School of Food Science, Jiangnan University; Singapore-Peking University Research Centre for a Sustainable Low-Carbon Future
杂志
Applied Microbiology and Biotechnology（2014）
DOI
10.1007/s00253-014-5593-y
所属领域
代谢工程
关键词
AstaxanthinChlorella zofingiensisGenetic engineeringNorfluazonPhytoene desaturaseTransformation
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解决的核心问题

绿藻Chlorella zofingiensis缺乏遗传转化工具，无法通过基因工程手段提高其天然虾青素产量。

研究策略

利用位点定向突变获得耐Norflurazon且脱氢酶活性提高的PDS-L516F基因，构建由内源PDS、NIT、RBCS启动子驱动的转化载体，并采用基因枪和电穿孔法转化C. zofingiensis，筛选稳定转化子并分析类胡萝卜素积累。

研究路线图

100%
研究问题：绿藻缺乏遗传转化工具，虾青素产量难提升
策略：PDS定点突变，构建多种启动子载体
关键改造1：PDS-L516F突变，抗性↑31倍，活性↑33%
关键改造2：RBCS启动子+内含子，效率↑91%
关键改造3：基因枪+电穿孔转化，效率14×10⁻⁶
结果：类胡萝卜素↑32%，虾青素↑35-54%
结论：PDS-L516F为显性标记，虾青素工程可行
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核心内容

针对绿藻Chlorella zofingiensis缺乏遗传转化工具、难以通过代谢工程提升天然虾青素产量的问题，本研究通过位点定向突变获得了耐Norflurazon且脱氢酶活性提高的PDS-L516F基因，构建由内源PDS、NIT、RBCS启动子驱动的转化载体，并利用基因枪和电穿孔法建立了该藻的稳定核转化系统。结果显示，L516F突变使PDS对Norflurazon抗性提高31倍，脱氢酶活性提高33%；RBCS启动子驱动转化效率最高，加入PDS第一个内含子后效率进一步提升91%，电穿孔法最高转化效率达14×10⁻⁶，为基因枪法的3.7倍。在高光与氮缺乏诱导条件下，转化子T9和T21的总类胡萝卜素含量分别较野生型提高32.1%和25.7%，虾青素含量最高提升54.3%，且PDS、BKT、CHYb转录水平上调。该研究首次实现了C. zofingiensis的稳定核转化，证明PDS-L516F可作为显性选择标记，过表达PDS能增强类胡萝卜素通量并在胁迫早期提升虾青素积累，为后续虾青素途径工程及该藻作为生产底盘奠定了基础。

创新点

['首次建立C. zofingiensis的稳定核转化系统', '利用内源RBCS启动子和PDS基因第一个内含子显著提高转化效率', '证明PDS-L516F可作为显性选择标记', '过表达PDS增强类胡萝卜素通量，提高总类胡萝卜素和虾青素产量']

研究对象（8）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Chlorella zofingiensis 类胡萝卜素生物合成 PDS phytoene desaturase 催化 野生型PDS，催化八氢番茄红素脱氢生成ζ-胡萝卜素
Chlorella zofingiensis 类胡萝卜素生物合成 PDS-L516F PDS-L516F mutant 催化 L516F点突变，耐Norflurazon且脱氢活性比野生型高33%，用作显性选择标记
Chlorella zofingiensis 类胡萝卜素生物合成 RBCS — 调控 内源RBCS启动子驱动PDS-L516F表达，转化效率高于PDS和NIT启动子
Chlorella zofingiensis 类胡萝卜素生物合成 PDS intron 1 — 调控 PDS基因第一个内含子，加入后转化效率提高91%
Chlorella zofingiensis 类胡萝卜素生物合成 NIT — 调控 内源硝酸还原酶基因启动子，用于驱动选择标记，但效率低于RBCS启动子
Chlorella zofingiensis 类胡萝卜素生物合成 BKT β-carotene ketolase 催化 转录水平在转化子中早期上调，与虾青素积累增加相关
Chlorella zofingiensis 类胡萝卜素生物合成 CHYb carotenoid hydroxylase 催化 转录水平在转化子中早期上调，参与虾青素合成
Chlorella zofingiensis 类胡萝卜素生物合成 PSY phytoene synthase 催化 转录水平在转化子和野生型间无显著差异

关键发现

  1. L516F突变使PDS对Norflurazon抗性提高31倍，脱氢酶活性提高33%；RBCS启动子驱动的转化效率最高；加入PDS第一个内含子使效率提高91%；电穿孔法最高转化效率为14×10^-6，是基因枪法的3.7倍；转化子T9和T21在HL-N诱导下总类胡萝卜素分别比野生型提高32.1%（9.3 vs
  2. 0 mg/g DW）和25.7%（8.8 vs
  3. 0 mg/g DW），虾青素分别提高35.3%（4.6 vs
  4. 4 mg/g DW）和23.5%（4.2 vs
  5. 4 mg/g DW），最高达54.3%（T21在24h时）；转化子PDS、BKT、CHYb转录水平上升，PSY无显著差异。

研究结论

PDS-L516F可作为C. zofingiensis的显性选择标记，过表达PDS能增加类胡萝卜素通量，在早期胁迫阶段提高虾青素积累，为虾青素途径工程提供可行策略，并有望推动该藻作为虾青素和生物燃料生产的底盘。