Engineering of Corynebacterium glutamicum for growth and L-lysine and lycopene production from N-acetyl-glucosamine
- 作者
- Christian Matano, Andreas Uhde, Jung-Won Youn, Tomoya Maeda, Lina Clermont, Kay Marin, Reinhard Kramer, Volker F. Wendisch, Gerd M. Seibold
- 单位
- Faculty of Biology and CeBiTec, Bielefeld University; Institute of Biochemistry, University of Cologne
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2014）
- DOI
- 10.1007/s00253-014-5676-9
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）无法利用N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）作为碳源，其基因组缺乏功能性GlcNAc摄取系统；需要引入外源摄取系统并增强内源代谢基因表达，以实现以GlcNAc为原料生产L-赖氨酸和番茄红素。
研究策略
从能利用GlcNAc的Corynebacterium glycinophilum DSM45794中鉴定并克隆编码GlcNAc特异性PTS透性酶的nagE基因；在C. glutamicum中异源表达nagE，同时过表达内源nagA和nagB基因，构建双质粒重组菌株，使GlcNAc被摄取并转化为果糖-6-磷酸进入糖酵解；最终在L-赖氨酸和番茄红素生产菌株中应用。
核心内容
针对谷氨酸棒杆菌无法利用N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）的问题，该研究从能以其为唯一碳源生长的Corynebacterium glycinophilum DSM45794中克隆了编码GlcNAc特异性PTS透性酶的nagE基因，并在C. glutamicum中异源表达，同时过表达内源nagA和nagB基因。重组菌株成功获得GlcNAc摄取能力，能以GlcNAc为唯一碳源、氮源和能源生长，双质粒菌株在100 mM GlcNAc上比生长速率达0.12 h^-1，最终OD600达40.0，GlcNAc完全消耗。在L-赖氨酸生产菌株DM1729中应用后，以GlcNAc为底物产生约25.7 mM L-赖氨酸，产率0.17 g/g底物，高于葡萄糖底物的0.14 g/g；而番茄红素生产菌株ΔcrtYEB在GlcNAc上的产量为17.4 mg/g CDW，低于葡萄糖上的51.5 mg/g CDW。该策略首次使谷氨酸棒杆菌能够利用几丁质衍生的氨基糖进行生长和产物合成，为利用甲壳素类废弃物生产氨基酸和萜类化合物提供了新底物途径，且L-赖氨酸产率的提高可能与GlcNAc提供额外氮源有关。
创新点
首次实现C. glutamicum对N-乙酰氨基葡萄糖的利用；鉴定C. glycinophilum nagE编码的功能性GlcNAc摄取透性酶；通过异源表达和同源过表达组合策略，使C. glutamicum能够以GlcNAc为唯一碳源、氮源和能源生长；证明GlcNAc可作为L-赖氨酸和番茄红素生产的新型底物，并发现L-赖氨酸产率较葡萄糖提高。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Corynebacterium glutamicum ATCC13032 | N-乙酰氨基葡萄糖分解代谢 | nagA, nagB | NagA (N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶), NagB (葡萄糖胺-6-磷酸脱氨酶) | 催化 | 过表达内源nagAB以增强GlcNAc-6-磷酸向果糖-6-磷酸的转化 |
| Corynebacterium glycinophilum DSM45794 | GlcNAc转运与代谢 | nagE | NagE (GlcNAc特异性PTS EII透性酶) | 转运 | 异源表达于C. glutamicum，实现GlcNAc的摄取和磷酸化 |
| Escherichia coli LR2-168 | GlcNAc转运 | nagE | NagE | 转运 | 用于验证C. glycinophilum nagE基因的功能 |
| Corynebacterium glutamicum M4 | N-乙酰氨基葡萄糖分解代谢 | nagA, nagB | NagA, NagB | 催化 | 自发突变菌株，nagAB启动子区突变导致表达增强，NagA活性较野生型高45倍 |
| Corynebacterium glutamicum DM1729 | L-赖氨酸生物合成 | lysC (P458S), hom (V59A), pyc (T3111) | 天冬氨酸激酶, 高丝氨酸脱氢酶, 丙酮酸羧化酶 | 催化 | L-赖氨酸生产菌株，携带解除反馈抑制的突变 |
| Corynebacterium glutamicum ΔcrtYEB | 类胡萝卜素生物合成 | crtYEB (缺失) | 番茄红素环化酶等 | 催化 | 敲除crtYEB以阻断番茄红素向其他类胡萝卜素转化，用于积累番茄红素 |
关键发现
- 在测试的17株棒杆菌中仅C. glycinophilum DSM45794能以GlcNAc为唯一碳源生长，其在GlcNAc和葡萄糖上的比生长速率分别为0.14±0.01和0.15±0.02 h^-1，最终OD600分别为7.9±0.7和8.2±1.1
- C. glutamicum过表达nagAB后NagA和NagB活性分别提高20倍和30倍，但无法利用GlcNAc，且无GlcNAc摄取
- C. glutamicum M4（pEKEx2-nagEBA）在GlcNAc上的比生长速率为0.07±0.02 h^-1，最终OD600为12.3±1.3，NagE介导的GlcNAc摄取动力学KM为3.8±0.6 μM，Vmax为3.8±0.2 nmol min^-1 (mg CDW)^-1
- 双质粒菌株C. glutamicum (pEKEx3-nagAB)(pVWEx1-nagE)在100 mM GlcNAc上比生长速率为0.12±0.01 h^-1，最终OD600为40.0±2.3，GlcNAc完全消耗，摄取速率为11.1±3.9 nmol min^-1 (mg CDW)^-1，以GlcNAc为唯一氮源时最终OD600达37.74±1.33
- L-赖氨酸生产菌株DM1729在GlcNAc上产生约25.7±1.5 mM L-赖氨酸，产率0.17±0.01 g Lys/g底物（葡萄糖上为17.0±2.7 mM，产率0.14±0.02 g/g）
- 番茄红素生产菌株ΔcrtYEB在GlcNAc上番茄红素产量为17.4±0.4 mg/g CDW，低于葡萄糖上的51.5±7.6 mg/g CDW。
研究结论
通过同时过表达C. glutamicum内源nagAB基因和异源表达C. glycinophilum的nagE基因，成功构建了能够利用N-乙酰氨基葡萄糖作为唯一碳源、氮源和能源的C. glutamicum菌株。该策略使C. glutamicum能够利用几丁质衍生的氨基糖生产L-赖氨酸和番茄红素，且以GlcNAc为底物时L-赖氨酸产率较葡萄糖显著提高，而番茄红素产量下降，这可能与GlcNAc提供额外氮源及乙酸盐代谢对碳流向的影响有关。