高级醇 · 代谢工程文献库

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Construction of a constitutively expressed homo-fermentative pathway in Lactobacillus brevis

作者
Wei Guo, Ronglin He, Lijuan Ma, Wendi Jia, Demao Li, Shulin Chen
单位
Tianjin Key Laboratory for Industrial BioSystem and Bioprocessing Engineering, Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, 32 Xiqidao, Airport Economic Park, Tianjin 300308, China
杂志
Applied Microbiology and Biotechnology（2014）
DOI
10.1007/s00253-014-5703-x
所属领域
代谢工程
关键词
Fructose-1,6-biphosphate aldolaseFructose-6-phosphate kinaseHomo-fermentativeLactic acidLactobacillus brevis
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解决的核心问题

Lactobacillus brevis 虽能同时利用葡萄糖和木糖且无碳代谢抑制，但通过异型发酵途径产生乙酸和乙醇副产物，导致乳酸产率低，需构建同型发酵途径以提高乳酸产量。

研究策略

将鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)的 pfkA（6-磷酸果糖激酶）和 fbaA（果糖-1,6-二磷酸醛缩酶）基因与强启动子P32融合，构建组成型表达载体 pMG36e-P32pfk-P32fba 和 pMG36e-P32fba，电转化进入 L. brevis s3f4，以引入糖酵解/同型发酵途径。

研究路线图

100%
研究问题：异型发酵导致乳酸产率低
策略：异源表达PFK和FBA构建同型发酵
关键改造1：构建pMG36e-P32pfk-P32fba载体
关键改造2：构建pMG36e-P32fba载体
关键改造3：电转化进入L. brevis s3f4
结果1：葡萄糖乳酸产率显著提高
结果2：FBA活性提升20-45倍
结果3：木糖时碳流仍走磷酸酮醇酶途径
结论：敲除xpk并提高fbaA表达
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核心内容

该研究针对短乳杆菌（Lactobacillus brevis）异型发酵导致乳酸产率低的问题，通过代谢工程手段构建同型发酵途径。研究者将鼠李糖乳杆菌的pfkA（6-磷酸果糖激酶）和fbaA（果糖-1,6-二磷酸醛缩酶）基因与强启动子P32融合，构建组成型表达载体并电转化进入L. brevis s3f4。结果显示，以葡萄糖为碳源时，转化株的乳酸产率分别达1.12和1.16 mol/mol，显著高于野生型的0.74 mol/mol，乳酸浓度从20.94 g/L提升至约32 g/L；仅表达fbaA即可显著提高乳酸产率，FBA酶活性较野生型提高20至45倍。代谢通量分析表明，在果糖-6-磷酸节点，转化株仅将不足20%的碳导向糖酵解途径，大部分碳仍流向磷酸酮醇酶途径。以木糖为碳源时，乳酸产率与野生型相近，说明内源XPK主导碳流分配。该研究证明异源表达PFK和FBA能有效构建同型发酵途径，但需进一步删除xpk基因并提高fbaA表达水平，方能使乳酸产率接近理论值。

创新点

首次在 L. brevis 中通过异源表达 PFK 和 FBA 构建组成型同型发酵途径；发现仅表达 fbaA 即可显著提高葡萄糖的乳酸产率；代谢通量分析揭示外源酶表达水平与碳流分配的关系。

研究对象（3）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Lactobacillus brevis s3f4 EMP/糖酵解途径 pfkA 6-磷酸果糖激酶(PFK) 催化 来自 Lactobacillus rhamnosus，由 P32 启动子组成型表达
Lactobacillus brevis s3f4 EMP/糖酵解途径 fbaA 果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(FBA) 催化 来自 Lactobacillus rhamnosus，由 P32 启动子组成型表达
Lactobacillus brevis s3f4 磷酸酮醇酶途径 xpk 磷酸酮醇酶(XPK) 催化 内源酶，负责木糖代谢中碳流分配，将大部分碳导向磷酸酮醇酶途径

关键发现

  1. 以葡萄糖为碳源，转化株 L. brevis pf 和 pp 的乳酸产率分别达
  2. 12 和
  3. 16 mol/mol，高于野生型的
  4. 74 mol/mol；乳酸浓度分别达
  5. 36±0.79 和
  6. 71±0.97 g/l，野生型为
  7. 94±0.58 g/l。转化株的总碳回收率（乳酸+乙酸+乙醇）为
  8. 98-0.99 mol/mol，野生型为
  9. 86 mol/mol。FBA 酶活性在转化株中达
  10. 22 和
  11. 45 U/ml，比野生型高约 20 和 45 倍，但比 L. rhamnosus 低约 10 倍。以木糖为碳源时，转化株乳酸产率与野生型相近（1.29-1.30 对
  12. 20 mol/mol），碳流仍主要流向磷酸酮醇酶途径。代谢通量分析显示，在果糖-6-磷酸节点，转化株仅将 277 或 357 mmol 碳转化为 GAP（占 1735 或 1773 mmol 的不到 20%），大部分碳仍进入磷酸酮醇酶途径。

研究结论

通过在 L. brevis s3f4 中组成型表达 pfkA 和 fbaA，成功构建了同型发酵途径，显著提高了葡萄糖的乳酸产率。然而以木糖为碳源时效果不明显，因为内源磷酸酮醇酶(XPK)主导碳流分配。未来可通过删除 xpk 基因切断磷酸酮醇酶途径并提高 fbaA 表达水平，使乳酸产率接近理论值。