The astaxanthin dideoxyglycoside biosynthesis pathway in Sphingomonas sp. PB304
- 作者
- Se Hyeuk Kim, Jin Ho Kim, Bun Yeol Lee, Pyung Cheon Lee
- 单位
- The Novo Nordisk Foundation Center for Biosustainability, Technical University of Denmark; Department of Molecular Science and Technology and Department of Applied Chemistry and Biological Engineering, Ajou University
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2014）
- DOI
- 10.1007/s00253-014-6050-7
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
阐明Sphingomonas sp. PB304中虾青素二脱氧糖苷的生物合成途径及其关键酶的功能
研究策略
构建fosmid文库并用简并PCR探针筛选类胡萝卜素合成基因簇；通过大肠杆菌异源表达和功能互补验证各酶活性；采用HPLC/MS和NMR鉴定产物结构；结合体外酶活测定和系统发育分析提出完整合成途径
核心内容
研究通过构建Sphingomonas sp. PB304的fosmid文库并结合简并PCR探针筛选，获得两个编码六个推测类胡萝卜素合成酶的基因簇（crtB、crtI、crtY、crtZ、crtW和crtX）。利用大肠杆菌异源表达与功能互补实验证实，除crtX外其余五个基因均具有催化活性，依次生成番茄红素、β-胡萝卜素、玉米黄质和虾青素。HPLC/MS和NMR分析鉴定该菌主要类胡萝卜素为虾青素二脱氧糖苷，其分子离子峰m/z 889.3 [M+H]+，特征碎片依次丢失两个146 Da的脱氧糖单元。体外酶活测定显示PB304的CrtX不能利用UDP-葡萄糖或GDP-岩藻糖作为糖供体，而Pantoea agglomerans的CrtX则可利用两者分别生成虾青素葡萄糖苷和单岩藻糖苷；系统发育分析表明PB304的CrtX虽属于类胡萝卜素葡萄糖基转移酶家族，但可能特异性催化GDP-脱氧糖的转移，提示其是一种新型脱氧糖基转移酶。该途径的阐明增进了对Sphingomonas属类胡萝卜素糖基化演化机制的理解，并为异源生产结构多样的类胡萝卜素糖苷提供了新的基因资源。
创新点
首次提出Sphingomonas sp. PB304中虾青素二脱氧糖苷的完整生物合成途径；发现并表征一个可能的新型脱氧糖基转移酶CrtX，其可能以GDP-脱氧糖而非UDP-葡萄糖为糖供体；通过系统发育分析揭示了类胡萝卜素糖基转移酶的底物选择性特征
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli (异源表达宿主) | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtB | CrtB (八氢番茄红素合酶) | 催化 | 催化两个香叶基香叶基二磷酸(GGPP)分子缩合生成八氢番茄红素（phytoene） |
| Escherichia coli (异源表达宿主) | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtI | CrtI (八氢番茄红素脱氢酶) | 催化 | 催化八氢番茄红素脱氢生成番茄红素（lycopene） |
| Escherichia coli (异源表达宿主) | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtY | CrtY (番茄红素环化酶) | 催化 | 催化番茄红素两端环化生成β-胡萝卜素 |
| Escherichia coli (异源表达宿主) | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtZ | CrtZ (β-胡萝卜素羟化酶) | 催化 | 催化β-胡萝卜素C-3位羟化生成玉米黄质 |
| Escherichia coli (异源表达宿主) | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtW | CrtW (β-胡萝卜素酮酶) | 催化 | 催化玉米黄质C-4位酮基化生成虾青素 |
| Escherichia coli (异源表达宿主) | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtX | CrtX (脱氧糖基转移酶) | 催化 | 推测催化虾青素两端连接脱氧糖基生成虾青素二脱氧糖苷；体外未能利用UDP-葡萄糖或GDP-岩藻糖 |
| Sphingomonas sp. PB304 | 虾青素二脱氧糖苷生物合成途径 | — | — | — | 原始生产菌株，主要类胡萝卜素为虾青素二脱氧糖苷 |
关键发现
- Sphingomonas sp. PB304的主要类胡萝卜素被鉴定为虾青素二脱氧糖苷，其分子离子峰m/z
- 3 [M+H]+，碎片离子m/z
- 2 [M-146+H]+和m/z
- 2 [M-146-146+H]+，UV/Vis λmax=478 nm；16S rRNA序列分析表明该菌与Sphingomonas astaxanthinifaciens TDMA-17^T、S. humi PB323^T、S. kaistensis PB56^T的相似性分别为97.78%、98.94%、98.24%；通过fosmid文库筛选获得两个基因簇，共编码六个推测的类胡萝卜素合成酶：CrtB、CrtI、CrtY、CrtZ、CrtW和CrtX；功能互补实验证实除CrtX外，CrtB、CrtI、CrtY、CrtZ、CrtW均在大肠杆菌中有活性，分别催化生成番茄红素、β-胡萝卜素、玉米黄质和虾青素；体外反应显示Sphingomonas sp. PB304 CrtX不能利用UDP-葡萄糖或GDP-岩藻糖作为糖供体，而Pantoea agglomerans CrtX可以利用UDP-葡萄糖和GDP-岩藻糖产生虾青素葡萄糖苷和虾青素单岩藻糖苷；系统发育分析表明PB304 CrtX位于类胡萝卜素葡萄糖基转移酶家族内，但很可能催化GDP-脱氧糖的转移；与S. astaxanthinifaciens中虾青素二脱氧糖苷占总类胡萝卜素的58.4%不同，PB304以该化合物为主要类胡萝卜素。
研究结论
本研究提出了Sphingomonas sp. PB304中虾青素二脱氧糖苷的生物合成途径，该途径由CrtB、CrtI、CrtY、CrtZ、CrtW和CrtX六个酶依次催化完成，其中CrtX可能是一种新型的脱氧糖基转移酶。该途径的阐明增进了对Sphingomonas属类胡萝卜素合成演化的理解，并为异源生产多样类胡萝卜素提供了基因资源。