The consequence of an additional NADH dehydrogenase paralog on the growth of Gluconobacter oxydans DSM3504
- 作者
- D. Kostner, B. Luchterhand, A. Junker, S. Volland, R. Daniel, J. Buchs, W. Liebl, A. Ehrenreich
- 单位
- Lehrstuhl fur Mikrobiologie, Technische Universitat Munchen; Department of Genomic and Applied Microbiology & Gottingen Genomics Laboratory, Georg-August University Gottingen; Department of Biochemical Engineering, RWTH Aachen University
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2014）
- DOI
- 10.1007/s00253-014-6069-9
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
Gluconobacter oxydans 工业菌株 ATCC 621H 底物氧化速率高但生长产量低，而 DSM 3504 生长产量高，本文旨在通过基因组比较和基因操作揭示造成生长差异的关键基因，特别是额外的 NADH 脱氢酶对生长和呼吸链电子分配的影响。
研究策略
对 G. oxydans DSM 3504 进行全基因组测序并与 ATCC 621H 比较，构建 ndh、tpiA、g2dh 缺失突变株及双缺失突变株，并在 ATCC 621H 中过表达额外的 ndh 基因；利用 RAMOS 和 BioLector 在线监测生长、氧气/二氧化碳转移速率、NADH/FAD 等，结合 HPLC 测量底物消耗。
核心内容
对Gluconobacter oxydans DSM 3504进行全基因组测序并与工业菌株ATCC 621H比较，发现额外的II型NADH脱氢酶（ndh）和磷酸丙糖异构酶（tpiA）是造成两菌株生长差异的关键基因。DSM 3504在葡萄糖上的生长产量约为ATCC 621H的三倍。构建单基因及双基因缺失突变株后发现，Δndh突变株培养30小时生物量比野生型低30%以上，最大氧气/二氧化碳转移速率仅为11 mmol/L/h（野生型约30 mmol/L/h），NADH和FAD浓度分别降低45%和30%。ΔtpiA突变株也表现出生长减弱，而Δg2dh无显著影响。在ATCC 621H中过表达ndh后，散射光从6×10³增至40×10³ a.u.，积分氧气转移速率从78增至130 mmol/L，OD600从1.8增至4，且几乎不积累副产物果糖。结果表明NDH-2通过与膜结合脱氢酶竞争电子传递促进NADH再氧化，对生物量形成至关重要，调控其活性可作为优化工业菌株生长和氧化发酵效率的有效策略。
创新点
鉴定出额外的 type II NADH dehydrogenase（ndh）和 triosephosphate isomerase（tpiA）是导致两菌株生长差异的重要因素；证明 NADH 脱氢酶与膜结合脱氢酶竞争电子传递；通过过表达 ndh 显著提高 ATCC 621H 的生物量。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Gluconobacter oxydans DSM 3504 | 电子传递链 | ndh (GLS_c05650) | type II NADH dehydrogenase (NDH-2) | 催化 | 额外的 NADH 脱氢酶，缺失导致生长显著下降 |
| Gluconobacter oxydans DSM 3504 | 甘露醇代谢（戊糖磷酸途径相关） | tpiA (GLS_c05720) | triosephosphate isomerase (TPI) | 催化 | 额外的磷酸丙糖异构酶，缺失导致生长下降 |
| Gluconobacter oxydans DSM 3504 | 葡萄糖酸代谢 | g2dh (GLS_c05030/GLS_c05040) | gluconate 2-dehydrogenase (G2dh) | 催化 | 额外的葡萄糖酸 2-脱氢酶，缺失对甘露醇生长无显著影响 |
| Gluconobacter oxydans DSM 3504 | 甘露醇氧化 | polyol dehydrogenase（膜结合） | polyol dehydrogenase (Polyol DH) | 催化 | 与 NDH 竞争电子传递，受 NDH 活性影响 |
| Gluconobacter oxydans ATCC 621H | 电子传递链 | ndh（内源） | NADH dehydrogenase (NDH) | 催化 | 内源 NDH，过表达额外的 ndh 显著提高生长和生物量 |
| Gluconobacter oxydans DSM 3504 | 电子传递链 | ndh + tpiA（双缺失） | NDH-2 和 TPI | 催化 | 双缺失导致生长进一步下降，生物量在所有菌株中最低 |
关键发现
- DSM3504 菌株的生长产量约为 ATCC621H 的三倍（在葡萄糖上）。Δndh 突变株培养 30 h 后生物量比野生型低 30% 以上，NADH 和 FAD 浓度分别降低 45% 和 30%；Δndh 突变株 OTR/CTR 最大仅 11 mmol/L/h（野生型约 30 mmol/L/h），积分 OTR 为 140 mmol/L（野生型 200 mmol/L）；Δndh 突变株 24 h OD600 为
- 8（野生型
- 9），残余果糖
- 9 g/L（野生型
- 5 g/L）。ΔtpiA 突变株最大 OTR 约 24 mmol/L/h，积分 OTR 180 mmol/L，OD600 低于 4。ΔndhΔtpiA 双突变积分 OTR 120 mmol/L，残余果糖
- 4 g/L。Δg2dh 无显著影响。ATCC621H 过表达 ndh（pAJ78）后散射光从 6×10^3 a.u. 增至 40×10^3 a.u.，NADH 从 1×10^3 到 40×10^3 a.u.，FAD 从 1×10^3 到 23×10^3 a.u.，积分 OTR 从 78 mmol/L 到 130 mmol/L，OD600 从
- 8 增至 4，且几乎不积累果糖。
研究结论
额外的 NADH 脱氢酶（NDH-2）对 Gluconobacter oxydans 的生长和生物量形成至关重要，它通过与膜结合脱氢酶竞争电子传递，促进 NADH 再氧化和可溶性代谢，从而增加生物量。调控 NDH 活性可作为优化工业菌株生长和氧化发酵效率的关键策略。