Two strictly polyphosphate-dependent gluco(manno)kinases from diazotrophic Cyanobacteria with potential to phosphorylate hexoses from polyphosphates
- 作者
- Tomás Albi, Aurelio Serrano
- 单位
- Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis, Centro de Investigaciones Científicas Isla de la Cartuja, CSIC y Universidad de Sevilla, Av. Américo Vespucio 49, 41092 Sevilla, Spain
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2014）
- DOI
- 10.1007/s00253-014-6184-7
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
从固氮蓝藻中鉴定并表征严格依赖多聚磷酸盐（polyP）的葡萄糖(甘露糖)激酶，以利用廉价的polyP替代ATP实现己糖磷酸化，为糖磷酸酯的酶法合成提供新途径。
研究策略
克隆鱼腥藻/念珠藻（Nostoc sp. PCC7120和Nostoc punctiforme PCC73102）中的单拷贝ppgK基因，在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达，通过镍亲和层析和FPLC凝胶过滤纯化重组蛋白，进行底物特异性、动力学参数、生化特性（pH、温度、金属离子依赖性）表征，并通过Southern blot和系统发育分析调查同源基因在蓝藻中的分布。
核心内容
本研究从固氮蓝藻Nostoc sp. PCC7120和Nostoc punctiforme PCC73102中克隆了单拷贝的ppgK基因（all1371和Npun_R1878），并在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达，通过镍亲和层析和凝胶过滤纯化获得重组蛋白NsPPGK和NpPPGK。生化表征显示二者均为同源二聚体，亚基约27 kDa，严格依赖多聚磷酸盐（polyP）作为磷酸供体，不能利用ATP、GTP等核苷三磷酸，其中P₄是最短活性底物。葡萄糖磷酸化比活力分别为229.1和174.3 μmol min⁻¹ mg⁻¹，甘露糖磷酸化活性较弱（约2–3 μmol min⁻¹ mg⁻¹），无果糖激酶活性。随着polyP链长从P₄增至长链，NsPPGK的kcat从4.9 s⁻¹升至151.4 s⁻¹，催化效率提高近19倍，而Km基本不变；最适pH为8.5–9.0，最适温度约45°C，镁离子为最佳辅因子。Southern blot及活性检测表明该酶广泛存在于固氮蓝藻中，而单细胞非固氮蓝藻缺乏此酶。这些结果揭示蓝藻PPGK代表一个严格polyP依赖的葡萄糖(甘露糖)激酶新亚家族，具有酶学特征的古老性，可利用廉价稳定的无机polyP替代ATP实现己糖磷酸化，为葡萄糖-6-磷酸和甘露糖-6-磷酸的酶法合成提供了无需ATP再生系统的新途径。
创新点
首次从蓝藻中分离和表征聚磷酸葡萄糖激酶（PPGK）；发现蓝藻PPGK严格依赖polyP作为磷酸供体，不能利用ATP或其他NTP；具有较弱的甘露糖激酶活性但无果糖激酶活性；对长链polyP（≥P60）亲和力更高；呈碱性pH最适（约9.0）和显著热稳定性（最适温度45°C）；代表蓝藻门特异的、严格polyP依赖的葡萄糖(甘露)激酶新亚家族，具有祖先特征和高生物技术潜力。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 大肠杆菌BL21(DE3) | 异源表达 | all1371 | NsPPGK | 催化 | 来自Nostoc sp. PCC7120的聚磷酸葡萄糖激酶基因，在大肠杆菌中重组表达，催化葡萄糖+polyP→葡萄糖6-磷酸 |
| 大肠杆菌BL21(DE3) | 异源表达 | Npun_R1878 | NpPPGK | 催化 | 来自Nostoc punctiforme PCC73102的聚磷酸葡萄糖激酶基因，在大肠杆菌中重组表达，催化葡萄糖+polyP→葡萄糖6-磷酸 |
| Nostoc sp. PCC7120 | 己糖磷酸化 | all1371 | NsPPGK | 催化 | 蓝藻天然宿主，严格依赖polyP磷酸化葡萄糖和甘露糖 |
| Nostoc punctiforme PCC73102 | 己糖磷酸化 | Npun_R1878 | NpPPGK | 催化 | 蓝藻天然宿主，严格依赖polyP磷酸化葡萄糖和甘露糖 |
关键发现
- 重组蓝藻PPGK（NsPPGK和NpPPGK）为同源二聚体，亚基分子量约27 kDa（天然分子量分别为49.4 kDa和55.1 kDa）
- 两者的葡萄糖磷酸化比活力分别为229.1±14.0和174.3±14.7 μmol min⁻¹ mg⁻¹，甘露糖磷酸化比活力分别为3.1±0.2和2.0±0.1 μmol min⁻¹ mg⁻¹
- 不利用ATP、CTP、GTP、TTP或dATP，仅以polyP为磷酸供体，P₄是最短活性底物
- 随着polyP链长从P₄增至PLC，NsPPGK的kcat从4.9 s⁻¹增至151.4 s⁻¹，催化效率（kcat/Km）从164 mM⁻¹ s⁻¹增至3059 mM⁻¹ s⁻¹，而Km基本不变（约30-50 μM）
- 镁离子为最佳辅因子，Km(Mg²⁺)=1.3 mM
- 最适pH为8.5-9.0，最适温度约45°C，在50°C孵育30 min后保留45%活性
- Southern blot和活性检测表明该酶广泛存在于固氮蓝藻（section II-V）中，而单细胞非固氮蓝藻（如Synechocystis sp. PCC6803）中无此酶。
研究结论
来自固氮蓝藻的PPGK代表一个严格polyP依赖的葡萄糖(甘露糖)激酶新亚家族，具有酶学特征古老性和较高的生物技术应用潜力，可利用稳定且廉价的无机多聚磷酸盐替代ATP，实现葡萄糖6-磷酸和甘露糖6-磷酸的酶法合成，无需ATP再生系统。