Enhanced expression of the codon-optimized exo-inulinase gene from the yeast \*Meyerozyma guilliermondii\* in \*Saccharomyces\* sp. W0 and bioethanol production from inulin
- 作者
- Guang-Lei Liu, Ge-Yi Fu, Zhe Chi, Zhen-Ming Chi
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2014）
- DOI
- 10.1007/s00253-014-6079-7
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
酿酒酵母不能高效利用菊粉生产乙醇，外源菊粉酶表达量低，需要增强外切菊粉酶基因在酿酒酵母中的表达以提高菊粉乙醇的产量和效率。
研究策略
根据酿酒酵母密码子偏好性优化来自Meyerozyma guilliermondii的外切菊粉酶基因INU1，同时消除不稳定顺式作用元件，将优化基因INU1Y和天然基因INU1分别连接至同源整合表达载体pMIRSC11并转化酿酒酵母Saccharomyces sp. W0，筛选高酶活重组菌株并比较其乙醇发酵性能。
核心内容
该研究针对酿酒酵母难以高效利用菊粉生产乙醇的问题，对来自Meyerozyma guilliermondii的外切菊粉酶基因INU1进行了密码子优化，并同时消除不稳定顺式作用元件，将优化基因INU1Y与天然基因INU1分别连接至同源整合载体pMIRSC11，转化至酿酒酵母Saccharomyces sp. W0中。通过筛选获得的重组菌Y13（含INU1Y）外切菊粉酶活性达43.84 U/mL，较含天然基因的重组菌EX3（31.39 U/mL）提高37.4%，而野生型仅2.72 U/mL；其INU1Y转录水平为EX3的212.9%。在300 g/L菊粉发酵中，Y13的乙醇产量为126.30 mg/mL，乙醇生产率为2.25 mg/mL/h，均优于EX3和野生型，且总糖利用率约92%。结果表明，密码子优化结合顺式元件消除有效增强了外切菊粉酶基因在酿酒酵母中的表达，显著提升菊粉酶活性与乙醇生产效率，重组菌Y13在菊粉基乙醇生产中具有重要应用潜力。
创新点
首次对M. guilliermondii的外切菊粉酶基因进行密码子优化并在Saccharomyces sp. W0中表达；结合密码子优化和不稳定顺式元件消除，使重组菌外切菊粉酶活性显著提高，获得迄今报道的最高外切菊粉酶活性的重组酿酒酵母。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces sp. W0 | 菊粉乙醇发酵 | INU1Y | 外切菊粉酶 (exo-inulinase) | 催化 | 密码子优化基因，GenBank号KJ939347，在重组菌Y13中表达，菊粉酶活性43.84 U/mL |
| Saccharomyces sp. W0 | 菊粉乙醇发酵 | INU1 | 外切菊粉酶 (exo-inulinase) | 催化 | Meyerozyma guilliermondii来源的天然基因，GenBank号EU195799，在重组菌EX3中表达，菊粉酶活性31.39 U/mL |
关键发现
- 重组菌Y13（含优化基因INU1Y）菊粉酶活性为43.84 U/mL，比含天然基因INU1的重组菌EX3（31.39 U/mL）提高37.4%，而野生型W0仅为2.72 U/mL
- 转录水平上，Y13的INU1Y相对表达量为EX3的212.9%（EX3设为100%）
- 在300 g/L菊粉发酵中，Y13乙醇产量为126.30 mg/mL，高于EX3（122.75 mg/mL）和W0（114.15 mg/mL）
- 250 g/L菊粉时，Y13产乙醇114.45 mg/mL，EX3为113.15 mg/mL，W0为97.45 mg/mL
- 48小时内Y13的乙醇生产率为2.25 mg/mL/h（300 g/L菊粉）和2.08 mg/mL/h（250 g/L菊粉），分别高于EX3的1.97和1.95 mg/mL/h，以及W0的1.77和1.70 mg/mL/h
- Y13的总糖利用率约92%，还原糖利用率约99%
- 优化基因INU1Y与天然基因INU1核苷酸序列一致性为78.71%。
研究结论
密码子优化有效增强了外切菊粉酶基因在酿酒酵母中的表达，提高了菊粉酶活性和菊粉乙醇产量，重组菌Y13在菊粉乙醇生产中具有重要应用潜力。