高级醇 · 代谢工程文献库

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Experimental design-aided systematic pathway optimization of glucose uptake and deoxyxylulose phosphate pathway for improved amorphadiene production

作者
Congqiang Zhang, Ruiyang Zou, Xixian Chen, Gregory Stephanopoulos, Heng-Phon Too
单位
Chemical and Pharmaceutical Engineering, Singapore-MIT Alliance, 4 Engineering Drive 3, Singapore, Singapore; Department of Biochemistry, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 8 Medical Drive, Blk MD7, #05-04, Singapore 117597, Singapore; Department of Chemical Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 77 Massachusetts Avenue, Cambridge, MA, USA
杂志
Applied Microbiology and Biotechnology（2015）
DOI
10.1007/s00253-015-6463-y
所属领域
代谢工程
关键词
AmorphadieneDeoxyxylulose phosphate pathwayExperimental design-aided systematic pathway optimizationMultivariate-modular approachThe phosphotransferase system
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解决的核心问题

在大肠杆菌中生产青蒿素前体紫穗槐二烯（AD）时，DXP途径两种前体甘油醛-3-磷酸（GAP）和丙酮酸（PYR）不平衡，限制了AD的产量；同时，葡萄糖摄取途径对前体供给有重要影响，需要系统优化以提高产量。

研究策略

采用实验设计辅助的系统途径优化（EDASPO）方法，利用T7启动子及其变体（TM1/TM2/TM3）同时调控四个关键模块（galP-glk、dxs、ispDF-idi、ispA-ADS）的表达，并结合回归模型预测最优表达比例；同时用ATP依赖的半乳糖透性酶和葡萄糖激酶系统（GGS）替代PTS以平衡前体。

研究路线图

100%
研究问题：DXP途径前体不平衡，AD产量受限
策略：EDASPO方法调控四模块表达
改造1：GGS系统替代PTS
改造2：T7启动子变体调控四模块（galP-glk, dxs, ispDF-idi, ispA-ADS）
改造3：过表达ppsA平衡前体
结果1：PGG菌株AD产量提高5倍（11→60 mg/L）
结果2：P1211菌株AD产量68.9 mg/L
结果3：P2000菌株AD产量201.2 mg/L（总提高19倍）
结论：EDASPO方法可推广至多模块代谢途径优化
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核心内容

本研究针对大肠杆菌中青蒿素前体紫穗槐二烯（AD）产量受DXP途径前体甘油醛-3-磷酸与丙酮酸不平衡限制的问题，提出实验设计辅助的系统途径优化策略。作者用T7启动子及其变体分别调控葡萄糖摄取（galP-glk）、DXP途径（dxs、ispDF-idi）和AD合成（ispA-ADS）四个模块的表达，以回归模型预测最优表达比例，同时用ATP依赖的半乳糖透性酶/葡萄糖激酶系统替代磷酸转移酶系统以平衡前体供给。敲除PTS并引入GGS后，AD产量从11 mg/L升至60 mg/L，过表达ppsA再增约2倍。仅用14个构建覆盖256种表达组合，发现不同构建产量差异超190倍，最优菌株P1211达68.9 mg/L。按回归分析预测的最优范围构建P2000，产量进一步提高至201.2 mg/L，较野生型提升约19倍，最适特异性产量18.0 mg/L/OD。结果表明EDASPO方法以少量实验实现多模块协同优化，为其他异源萜类途径的系统改造提供了可推广的范式。

创新点

1. 首次用GGS系统替代PTS，使AD产量提高5倍；2. 建立EDASPO方法，同时调控四个表达模块，仅用14个构建即可覆盖256种组合，通过回归分析预测最优表达范围；3. 发现ispDF过表达在某些条件下对AD生产不利，去除后进一步提高了产量。

研究对象（12）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Escherichia coli K12 MG1655 ΔrecAΔendA DE3 葡萄糖摄取途径 galP 半乳糖透性酶 转运 编码半乳糖透性酶，负责将葡萄糖转运进入细胞；在PTS缺失株中过表达以恢复葡萄糖摄取，并在四模块系统中作为第一模块受T7启动子变体调控。
Escherichia coli K12 MG1655 ΔrecAΔendA DE3 葡萄糖摄取途径 glk 葡萄糖激酶 催化 编码葡萄糖激酶，利用ATP磷酸化葡萄糖生成葡萄糖-6-磷酸；与galP共同组成GGS系统，替代PTS的葡萄糖摄取功能。
Escherichia coli K12 MG1655 ΔrecAΔendA DE3 糖酵解/糖异生途径 ppsA 磷酸烯醇式丙酮酸合成酶 催化 编码PEP合成酶，催化丙酮酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸（PEP），提高胞内PEP水平，从而平衡GAP和PYR比例，增强DXP途径前体供应。
Escherichia coli K12 MG1655 ΔrecAΔendA DE3 DXP途径 dxs 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 催化 编码DXP合酶，催化丙酮酸和GAP缩合生成DXP，是DXP途径的第一个关键酶，作为第二模块受启动子调控。
Escherichia coli K12 MG1655 ΔrecAΔendA DE3 DXP途径 ispD 2C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸胞苷酰转移酶 催化 位于ispDF操纵子中，催化MEP转化为CDPME，参与DXP途径中间体转化。
Escherichia coli K12 MG1655 ΔrecAΔendA DE3 DXP途径 ispF 2C-甲基-D-赤藓醇2,4-环二磷酸合酶 催化 位于ispDF操纵子中，催化CDPMEP转化为MEC，参与DXP途径中间体转化。
Escherichia coli K12 MG1655 ΔrecAΔendA DE3 DXP途径 idi 异戊烯基焦磷酸异构酶 催化 编码IPP异构酶，催化异戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）之间的互变，平衡两者比例，作为第三模块的一部分。
Escherichia coli K12 MG1655 ΔrecAΔendA DE3 AD合成途径 ispA 法尼基焦磷酸合酶 催化 编码FPP合酶，催化IPP和DMAPP缩合生成法尼基焦磷酸（FPP），为AD合成提供底物，作为第四模块的一部分。
Escherichia coli K12 MG1655 ΔrecAΔendA DE3 AD合成途径 ADS 紫穗槐二烯合酶 催化 编码紫穗槐二烯合酶，催化FPP环化生成紫穗槐二烯（AD），是异源表达的关键酶，作为第四模块的一部分。
Escherichia coli K12 MG1655 ΔrecAΔendA DE3 葡萄糖摄取途径（PTS系统） ptsH 组氨酸磷酸载体蛋白（HPr） 转运 编码PTS系统组分HPr，参与葡萄糖磷酸转移；在构建ΔPTS::FRT菌株时被敲除（连同ptsI、crr）。
Escherichia coli K12 MG1655 ΔrecAΔendA DE3 葡萄糖摄取途径（PTS系统） ptsI 磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶酶I 转运 编码PTS系统酶I，参与磷酸基团转移；在ΔPTS::FRT菌株中被敲除。
Escherichia coli K12 MG1655 ΔrecAΔendA DE3 葡萄糖摄取途径（PTS系统） crr 葡萄糖特异性磷酸转移酶酶IIA 转运 编码PTS系统酶IIA成分，参与葡萄糖磷酸转移；在ΔPTS::FRT菌株中被敲除。

关键发现

  1. 敲除PTS并过表达GGS系统（菌株PGG）使AD产量从11 mg/L提高到60 mg/L，提高约5倍
  2. 过表达ppsA使AD产量提高约2倍
  3. 野生型中过表达GGS（MGG）使AD产量从10 mg/L提高到37 mg/L（约3倍多）
  4. 通过四模块优化，最高产量达68.9 mg/L（菌株P1211，0.01 mM IPTG），不同构建间AD产量差异超过190倍
  5. 根据回归分析预测最优表达范围后，构建的P2000菌株产量进一步提高到201.2 mg/L，较P1211提高约3倍，总产量较野生型提高约19倍
  6. 最适特异性产量达18.0 mg/L/OD，是已报道的DXP途径最高产量之一。

研究结论

EDASPO方法成功应用于系统优化多模块代谢途径，通过平衡GAP和PYR前体、优化葡萄糖摄取和DXP途径关键基因表达，显著提高了紫穗槐二烯产量；该方法具有预测性强、实验量小的优点，可推广至其他产品途径的优化。