Coexpression of Lactobacillus brevis ADH with GDH or G6PDH in Arxula adeninivorans for the synthesis of 1-(R)-phenylethanol
- 作者
- Marion Rauter, Alexandra Prokoph, Jakub Kasprzak, Karin Becker, Keith Baronian, Rüdiger Bode, Gotthard Kunze, H.-Matthias Vorbrodt
- 单位
- Organtis Chemicals GmbH; Leibniz Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research (IPK); University of Canterbury; Institute of Microbiology, University of Greifswald
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2014）
- DOI
- 10.1007/s00253-014-6297-z
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
实现高效、对映体纯的1-(R)-苯乙醇生物合成，需要解决(R)-选择性醇脱氢酶的表达及NADPH辅因子再生问题。
研究策略
在非常规酵母Arxula adeninivorans中共表达Lactobacillus brevis的(R)-选择性ADH与Bacillus megaterium的GDH或Bacillus pumilus的G6PDH，利用葡萄糖或葡萄糖-6-磷酸氧化再生NADPH；比较粗酶液、固定化酶、渗透化细胞和渗透化固定化细胞等多种酶制备形式的催化性能与稳定性，并测试半连续反应系统。
核心内容
本研究在非常规酵母Arxula adeninivorans中分别共表达短乳杆菌来源的(R)-选择性醇脱氢酶（LbADH）与巨大芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶（BmGDH）或短小芽孢杆菌葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（BpG6PDH），通过葡萄糖或葡萄糖-6-磷酸氧化实现NADPH辅因子再生，用于高效合成对映体纯的1-(R)-苯乙醇。其中共表达LbADH与BpG6PDH的菌株ADH活性达5200 U/L，共表达LbADH与BmGDH的菌株ADH活性为2700 U/L。两种菌株的粗酶液均可在60分钟内将40 mM苯乙酮完全转化为ee>99%的产物且无副产物。经比较多种酶制备形式，钙藻酸盐固定化渗透化细胞稳定性最佳，含BmGDH的菌株可重复使用超过52个循环，且当NADP+浓度降至0.1 mM时，其总转化数从39提升至391。在半连续反应运行300小时后，共分离得到38.5 g产品，其中含12.78 g目标产物，时空产率达9.74 g/L/day，产物ee为100%。结果表明A. adeninivorans是表达LbADH及其辅因子再生酶的优良宿主，其中BmGDH-LbADH组合因高稳定性和较高总转化数，更适用于连续化生产系统。
创新点
首次在A. adeninivorans中实现LbADH与BmGDH/BpG6PDH的共表达；采用钙藻酸盐固定化渗透化细胞（PICs）实现了多循环稳定运行（GDH再生系统达52个循环）；在半连续反应中获得了高时空产率和总转化数（TTN）。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Arxula adeninivorans MS1006 | 1-(R)-苯乙醇合成 | LbADH | (R)-特异性醇脱氢酶（LbADH） | 催化 | 来自Lactobacillus brevis，催化苯乙酮还原为1-(R)-苯乙醇，菌株A和B均表达 |
| Arxula adeninivorans MS1006 | NADPH再生 | BmGDH | 葡萄糖脱氢酶（BmGDH） | 催化 | 来自Bacillus megaterium，氧化葡萄糖再生NADPH，菌株A表达 |
| Arxula adeninivorans MS1006 | NADPH再生 | BpG6PDH | 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（BpG6PDH） | 催化 | 来自Bacillus pumilus，氧化葡萄糖-6-磷酸再生NADPH，菌株B表达 |
关键发现
- 共表达LbADH和BpG6PDH的菌株B的ADH活性达5200 U/L，G6PDH活性370 U/L
- 共表达LbADH和BmGDH的菌株A的ADH活性为2700 U/L，GDH活性170 U/L。两种菌株的粗酶液均能在60分钟内将40 mM苯乙酮完全转化为ee>99%的纯1-(R)-苯乙醇，无副产物。PICs最稳定，菌株A可重复使用超过52个循环，菌株B为14个循环。降低NADP+浓度至0.1 mM时，菌株A的TTN从39提高到391
- 菌株B在0.01 mM NADP+时TTN达2066。半连续反应（300 h）分离得到38.5 g产品，其中12.78 g为1-(R)-苯乙醇（33.2%），时空产率为9.74 g/L/day或406 g/kg干重/day，ee为100%，TTN为206。
研究结论
A. adeninivorans是生产LbADH及BpG6PDH/BmGDH的优良宿主，可为合成对映体纯醇提供简便方法；其中BmGDH-LbADH菌株因稳定性高和TTN（391）较高，更适合连续反应系统。