Enzymatic transformation of vina-ginsenoside R7 to rare notoginsenoside ST-4 using a new recombinant glycoside hydrolase from Herpetosiphon aurantiacus
- 作者
- Ru-Feng Wang, Ming-Min Zheng, Yue-De Cao, Hao Li, Chun-Xiu Li, Jian-He Xu, Zheng-Tao Wang
- 单位
- 中国药科大学生药学系，南京 210038；上海中医药大学中药研究所，中药标准化教育部重点实验室及中药新资源与质量评价国家中医药管理局重点实验室，上海 201203；华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237；华东理工大学上海生物制造技术协同创新中心，上海 200237
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2015）
- DOI
- 10.1007/s00253-015-6446-z
- 所属领域
- 生物催化与生物转化
- 关键词
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解决的核心问题
稀有皂苷notoginsenoside ST-4在天然植物中含量极低（仅0.00066%），缺乏简便高效的制备方法，本研究旨在建立一种利用重组酶从vina-ginsenoside R7转化制备ST-4的绿色便捷途径。
研究策略
从Herpetosiphon aurantiacus DSM 785中克隆糖苷水解酶基因HaGH03，在Escherichia coli BL21(DE3)中异源表达并纯化，系统表征其酶学性质，并用于催化vina-ginsenoside R7的底物特异性水解，实现向notoginsenoside ST-4的高效转化。
核心内容
稀有皂苷notoginsenoside ST-4在植物中含量极低，缺乏高效制备方法。本研究从Herpetosiphon aurantiacus DSM 785中克隆了糖苷水解酶基因HaGH03，并在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达与纯化。该酶含749个氨基酸，属于第3家族糖苷水解酶，催化位点为Asp233和Glu423。酶学表征显示，以pNPG为底物时KM为5.67 μM，kcat为69.2 /s。HaGH03能特异性水解人参皂苷C-20位葡萄糖，不影响C-3位糖基，表现出高度选择性。在pH 6.5、37°C条件下，2.5 mg/mL的vina-ginsenoside R7被完全转化，摩尔产率100%，时空产率达104 mg/L/h，放大制备获得约0.15 g纯度99%的ST-4。此外，该酶还能催化Rb1→Rd→Rg3、Rb2→C-Y等多种皂苷转化，但不能水解木糖、鼠李糖及阿拉伯糖基。研究建立了一条绿色便捷的ST-4酶法制备路线，为其他稀有人参皂苷的制备提供了新工具。
创新点
['首次鉴定出能够将vina-ginsenoside R7转化为notoginsenoside ST-4的酶HaGH03', 'HaGH03能特异性水解人参皂苷C-20位的葡萄糖，而不影响C-3位的外侧木糖和内侧葡萄糖，具有高度选择性', '实现了vina-ginsenoside R7的100%摩尔转化率，时空产率达104 mg/L/h', '提供了一种制备稀有皂苷ST-4的环保、简便方法，并为其他稀有人参皂苷的酶法制备提供了新工具']
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 重组蛋白表达 | HaGH03基因（2250 bp） | HaGH03 | 催化 | 异源表达宿主，用于生产重组糖苷水解酶HaGH03 |
| Herpetosiphon aurantiacus DSM 785 | 人参皂苷生物转化 | HaGH03 | HaGH03（Uniprot A9B3B2） | 催化 | 基因来源菌株；HaGH03能特异性水解vina-ginsenoside R7 C-20位的葡萄糖，将其转化为notoginsenoside ST-4 |
关键发现
- ['HaGH03由749个氨基酸组成，属于第3家族糖苷水解酶，与嗜热β-葡萄糖苷酶B具有48%的同一性，其预测催化活性位点为Asp233（亲核试剂）和Glu423（酸/碱）', '以pNPG为底物时KM=5.67±0.24 μM，kcat=69.2±0.31 /s
- 以vina-ginsenoside R7为底物时KM=0.59±0.23 mM，kcat=2.15±0.46 /min', '在优化条件（pH 6.5、37°C）下，2.5 mg/mL的vina-ginsenoside R7被完全转化，摩尔产率100%，时空产率104 mg/L/h', '通过放大制备获得约0.15 g notoginsenoside ST-4，纯度达99%', 'HaGH03能水解多种人参皂苷的特定位点：Rb1→Rd→Rg3、Rb2→C-Y、Rc→C-Mc、Re→Rg2、F1→PPT等，但不能水解木糖、鼠李糖及阿拉伯糖基', '最适pH为6.5，最适温度为50°C
- 在30°C、40°C、50°C下的半衰期分别为47.7 h、35.1 h、1.1 h']
研究结论
成功建立了一种环保且便捷的notoginsenoside ST-4制备方法，即通过重组糖苷水解酶HaGH03将vina-ginsenoside R7完全转化。HaGH03在E. coli中可溶表达，具有高选择性和高转化效率，在制备稀有皂苷（特别是ST-4）方面具有较大应用潜力。