Microbial diversity of mangrove sediment in Shenzhen Bay and gene cloning, characterization of an isolated phytase-producing strain of SPC09 B. cereus
- 作者
- Shengpeng Zhang, Shao-an Liao, Xiaoyuan Yu, Hongwu Lu, Jian-an Xian, Hui Guo, Anli Wang, Jian Xie
- 单位
- Key Laboratory of Ecology and Environmental Science of Guangdong Higher Education Institutes, Guangdong Provincial Key Laboratory for Healthy and Safe Aquaculture, College of Life Science, South China Normal University, Guangzhou 510631, People's Republic of China; South China Sea Marine Engineering and Environment Institute, State Oceanic Administration, Guangzhou 510300, People's Republic of China
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2015）
- DOI
- 10.1007/s00253-015-6405-8
- 所属领域
- 酶工程
- 关键词
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解决的核心问题
红树林沉积物中磷限制环境下的微生物多样性不明，且缺乏可高效溶解有机磷的植酸酶基因资源；需要分离产植酸酶菌株、克隆并表征新型植酸酶基因，以揭示磷循环机制并开发应用潜力
研究策略
通过454高通量测序分析红树林沉积物细菌群落结构；用植酸酶筛选培养基分离可培养产植酸酶细菌，结合16S rDNA系统发育分析；从高效菌株蜡状芽孢杆菌SPC09中克隆植酸酶基因Bc-phy，在大肠杆菌中异源表达、纯化并测定酶学性质；用qPCR定量环境样品中Bc-phy基因丰度
研究路线图
核心内容
研究通过454高通量测序和培养分离相结合的方式，解析了深圳湾红树林沉积物中细菌群落结构与产植酸酶菌株的多样性，发现优势菌门为Chloroflexi、Firmicutes和Proteobacteria，其中Bacillus占比4.95%。从沉积物中分离出29株产植酸酶细菌，磷溶解量介于163.36至579.01 mg/L，平均279.56 mg/L，其中蜡状芽孢杆菌SPC09活性最高。从中克隆到新型植酸酶基因Bc-phy，开放阅读框长1005 bp，编码约335个氨基酸，重组蛋白经Ni-NTA纯化后在SDS-PAGE中显示约38.4 kDa。酶学表征显示该酶最适温度为60°C、最适pH为6.5，且与已知芽孢杆菌植酸酶同源性最高仅70%，属于新酶资源。qPCR定量表明Bc-phy基因拷贝数在红树林沉积物中高于潮滩、表层高于底层，并在六月达到峰值（底层20,145.37拷贝/5ng DNA，表层42,511.66拷贝/5ng DNA）。该新型植酸酶可作为功能标记基因追踪磷循环微生物动态，同时为工程菌开发提供了具有应用潜力的新基因。
创新点
首次从红树林沉积物蜡状芽孢杆菌中克隆并表征新型植酸酶基因Bc-phy，该酶与已知芽孢杆菌植酸酶同源性低（最高70%相似性）但具有良好活性；发现环境因素比菌株来源对植酸酶基因进化的影响更大；将Bc-phy作为功能基因用于评估沉积物中磷溶解微生物的丰度
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Bacillus cereus SPC09 | 植酸水解/磷溶解 | Bc-phy | BC-PHY | 催化 | 分离自深圳湾红树林沉积物的原始产植酸酶菌株，磷溶解能力最高（579.01 mg/L） |
| Escherichia coli DH5α | 植酸水解/磷溶解 | Bc-phy | BC-PHY | 催化 | 用于异源表达重组植酸酶BC-PHY的宿主，经IPTG诱导和Ni-NTA亲和纯化获得活性酶 |
关键发现
- 红树林沉积物中优势菌门为Chloroflexi、Firmicutes和Proteobacteria，Bacillus占比4.95%
- 分离获得29株产植酸酶细菌，磷溶解量介于163.36~579.01 mg/L，平均279.56 mg/L，其中SPC09最高为579.01 mg/L
- 克隆的Bc-phy基因ORF长1005 bp，编码约335个氨基酸（文中亦描述为334个），理论分子量36.29 kDa
- 重组BC-PHY蛋白经Ni-NTA纯化后SDS-PAGE显示约38.4 kDa
- 最适反应温度为60°C，最适pH为6.5
- qPCR显示红树林沉积物中Bc-phy基因拷贝数高于潮滩，表层高于底层，六月达到峰值：底部20,145.37拷贝/5ng DNA，表层42,511.66拷贝/5ng DNA
研究结论
深圳湾红树林沉积物中蕴含丰富的产植酸酶细菌，Bacillus是重要类群；新克隆的Bc-phy基因编码一种新型植酸酶，在pH 6.5和60°C下活性最高，该基因的高丰度与红树林磷限制环境及植物生长密切相关，可作为功能标记基因用于监测磷循环微生物群落，并为工程菌开发提供新基因资源