Improvement of acetic acid tolerance of Saccharomyces cerevisiae using a zinc-finger-based artificial transcription factor and identification of novel genes involved in acetic acid tolerance

作者: Cui Ma, Xiaowen Wei, Cuihuan Sun, Fei Zhang, Jianren Xu, Xinqing Zhao, Fengwu Bai
单位: School of Life Science and Biotechnology, Dalian University of Technology; School of Life Science and Biotechnology, Shanghai Jiaotong University; Liaoning Academy of Microbiology
杂志: Applied Microbiology and Biotechnology（2015）
DOI: 10.1007/s00253-014-6343-x
所属领域: 代谢工程
关键词: Acetic acid toleranceArtificial transcription factor (ATF)Ethanol productionQDR3Saccharomyces cerevisiaeZinc finger protein (ZFP)
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解决的核心问题

提高酿酒酵母对纤维素水解液中乙酸抑制剂的耐受性，并鉴定参与乙酸耐受性的新基因。

研究策略

利用锌指蛋白人工转录因子（ZFP-TF）文库转化酿酒酵母，筛选乙酸耐受突变株；通过预测靶基因结合位点和实时PCR分析，鉴定调控靶基因并构建基因缺失突变体验证功能。

研究路线图

100%

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核心内容

本研究利用锌指蛋白人工转录因子（ZFP-TF）文库转化酿酒酵母S288c/ATCC4126，筛选获得乙酸耐受突变株Sc4126-M01。在5 g/L乙酸存在下，该突变株的过氧化氢酶（CAT）活性显著高于对照菌株，表明其抗氧化防御能力得到增强。通过预测ZFP-TF的靶基因结合位点并结合实时PCR分析，鉴定出QDR3和IKS1两个新参与乙酸耐受性的基因，二者在乙酸存在下转录水平分别降低1.59和1.37倍（log2 ratio）。进一步构建基因缺失突变体验证功能，发现QDR3缺失突变体在5 g/L乙酸条件下葡萄糖消耗速率和乙醇生产率均提高；在3 g/L乙酸条件下，ΔQDR3的生物量积累和糖利用加快，且ΔQDR3和ΔIKS1在乙酸或H2O2处理下均表现出增强的耐受性。结果表明，合成ZFP-TF文库可有效改善酿酒酵母的乙酸耐受性，人工转录因子为发掘胁迫耐受相关的新功能基因提供了有力工具，对纤维素水解液发酵生产燃料乙醇具有应用价值。

创新点

首次将ZFP-TF文库用于改善酿酒酵母乙酸耐受性；通过ZFP-TF预测靶基因，首次证明QDR3和IKS1基因参与乙酸耐受性。

研究对象（6）

底盘细胞	代谢通路	基因	蛋白	功能	说明
Saccharomyces cerevisiae (S288c/ATCC4126)	乙酸耐受性/乙醇发酵	ZFP-TF	人工锌指蛋白转录因子	调控	通过文库筛选获得，过表达可提高乙酸耐受性
Saccharomyces cerevisiae	乙酸耐受性	QDR3	Qdr3p	转运	多药转运蛋白，缺失突变提高乙酸耐受性及乙醇发酵性能
Saccharomyces cerevisiae	乙酸耐受性	IKS1	Iks1p	调控	蛋白激酶，缺失突变在乙酸休克下提高存活率，但对生长和发酵有负面影响
Saccharomyces cerevisiae	乙酸耐受性	YFL040W	假定转运蛋白	转运	转录水平下调，缺失突变未增强乙酸耐受性
Saccharomyces cerevisiae	乙酸耐受性	HAA1	Haa1p	调控	乙酸耐受性关键调控因子，转录水平在突变株中未显著变化
Saccharomyces cerevisiae	抗氧化防御	—	Catalase (CAT)	催化	在乙酸胁迫下Sc4126-M01中活性高于对照菌株

关键发现

从ZFP-TF文库筛得乙酸耐受突变株Sc4126-M01，在5 g/L乙酸存在下其过氧化氢酶(CAT)活性显著高于对照菌株
QDR3和IKS1在乙酸存在下转录水平分别降低1.59和1.37倍（log2 ratio）
QDR3缺失突变体在5 g/L乙酸条件下葡萄糖消耗速率和乙醇生产率提高
在3 g/L乙酸条件下ΔQDR3生物量积累和糖利用加快，且ΔQDR3和ΔIKS1在乙酸或H2O2处理下表现出增强的耐受性。

研究结论

合成ZFP-TF文库可用于改善酿酒酵母的乙酸耐受性，人工转录因子有助于发掘参与胁迫耐受的新功能基因。