The production of \(\omega\) -hydroxy palmitic acid using fatty acid metabolism and cofactor optimization in Escherichia coli
- 作者
- Changmin Sung, Eunok Jung, Kwon-Young Choi, Jin-hyung Bae, Minsuk Kim, Joonwon Kim, Eun-Jung Kim, Pyoung Il Kim, Byung-Gee Kim
- 单位
- Interdisciplinary Program for Bioengineering, Seoul National University, Seoul, South Korea; School of Chemical and Biological Engineering, Institute of Bioengineering, Seoul National University, Seoul, South Korea; School of Chemical and Biological Engineering, Institute of Molecular Biology and Genetics, Seoul National University, Seoul, South Korea; Department of Environmental Engineering, College of Engineering, Ajou University, Suwon, Gyeonggi-do, South Korea; Bio Control Research Institute, JBF, 495 Ipyneo-ro, Ipyneo, Gokseong-gun, Jeonnam, South Korea
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2015）
- DOI
- 10.1007/s00253-015-6630-1
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解决从葡萄糖直接高效合成ω-羟基棕榈酸的问题，重点克服脂肪酸前体供给和P450羟化反应中NADH辅因子不足的瓶颈。
研究策略
通过过表达硫酯酶(Lreu_0335)和脱水酶(fabZ)强化脂肪酸合成，敲除fadD阻断β-氧化，引入CYP153A与CamAB实现ω-羟化，并通过整合甲酸脱氢酶(fdh)和敲除adhE提高NADH/NAD+比例，最终实现ω-羟基棕榈酸的高产。
核心内容
该研究在大肠杆菌中构建了一条从葡萄糖直接合成ω-羟基棕榈酸的代谢途径。作者过表达硫酯酶Lreu_0335和脱水酶FabZ强化脂肪酸合成，敲除fadD阻断β-氧化，引入CYP153A与CamAB组成NADH依赖的ω-羟化系统，并通过整合甲酸脱氢酶及敲除adhE提升胞内NADH/NAD+比例。结果显示，仅强化脂肪酸合成时棕榈酸和硬脂酸产量分别达503 mg/L和508.4 mg/L，为野生型的1.6倍和2.3倍；引入羟化系统后ω-羟基棕榈酸达211.7 mg/L，占棕榈酸的42.1%，表明羟化反应是限速步骤。比较两类电子传递系统发现，NADH依赖的CYP153A+CamAB生产力是NADPH依赖融合系统的2.8倍。经辅因子优化后，胞内NADH浓度约增加2倍，最终工程菌产生610.8 mg/L ω-羟基棕榈酸，较优化前提高约3倍，为当时摇瓶培养中从葡萄糖合成的最高产量。该工作证实脂肪酸合成并非瓶颈，P450羟化效率及NADH供应才是关键限制因素，为羟化脂肪酸的微生物生产提供了优化方向。
创新点
1) 将脂肪酸合成途径与P450ω-羟化系统偶联，实现从葡萄糖直接合成ω-羟基棕榈酸；2) 系统比较了NADH依赖的CamAB与NADPH依赖的CYP102A1还原酶融合两种电子传递系统，发现前者效率更高；3) 通过染色体整合fdh和敲除adhE优化NADH供给，使ω-羟基棕榈酸产量提高约3倍，达到610.8 mg/l。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BW25113(DE3) | 脂肪酸生物合成 | Lreu_0335 | 硫酯酶 (thioesterase) | 催化 | 来源于Lactobacillus reuteri DSM20016，用于从ACP释放脂肪酸，促进游离脂肪酸积累 |
| Escherichia coli BW25113(DE3) | 脂肪酸生物合成 | fabZ | β-羟脂酰-ACP脱水酶 (β-hydroxyacyl-ACP dehydratase) | 催化 | 来源于E. coli，参与脂肪酸延长循环 |
| Escherichia coli BW25113(DE3) | 脂肪酸ω-羟化 | CYP153A | 细胞色素P450单加氧酶 (cytochrome P450 monooxygenase) | 催化 | 来源于Marinobacter aquaeolei VT8，催化长链脂肪酸末端ω-羟化 |
| Escherichia coli BW25113(DE3) | P450电子传递链 | camA | Putidaredoxin reductase (CamA) | 能量供给 | 来源于Pseudomonas putida，电子传递蛋白，与CamB协作向CYP153A提供还原力(NADH) |
| Escherichia coli BW25113(DE3) | P450电子传递链 | camB | Putidaredoxin (CamB) | 能量供给 | 来源于Pseudomonas putida，铁氧还蛋白，参与电子传递 |
| Escherichia coli BW25113(DE3) | NADH再生 | fdh | NAD+依赖性甲酸脱氢酶 (formate dehydrogenase) | 能量供给 | 来源于Candida boidinii，整合至染色体，催化甲酸氧化生成NADH |
| Escherichia coli BW25113(DE3) | 脂肪酸β-氧化 | fadD | 脂酰-CoA合成酶 (acyl-CoA synthase) | 催化 | 敲除该基因以阻断脂肪酸β-氧化，增加游离脂肪酸积累 |
| Escherichia coli BW25113(DE3) | 混合酸发酵/乙醇代谢 | adhE | 乙醇脱氢酶 (alcohol dehydrogenase) | 催化 | 敲除以减少NADH消耗，提高NADH/NAD+比例 |
| Escherichia coli BW25113(DE3) | 戊糖磷酸途径 | talA | 转醛醇酶 (transaldolase A) | 催化 | 敲除以断开PPP与糖酵解的联系，增加NADPH池（但对HFA产量影响不大） |
关键发现
- 通过过表达硫酯酶Lreu_0335、脱水酶fabZ并敲除fadD和talA，工程菌FFA4（无P450系统）可产生503.0 mg/l棕榈酸(C16)和508.4 mg/l硬脂酸(C18)，分别为野生型的约1.6倍和2.3倍；含P450系统的HFA4菌株产生211.7 mg/l ω-羟基棕榈酸，占总棕榈酸的42.1±0.1%，说明羟化反应为限速步骤；比较两类电子传递系统，CYP153A+CamAB（NADH依赖）的HFA1菌株8小时内从1 mM棕榈酸产生约0.9 mM ω-羟基棕榈酸，而CYP153A-还原酶融合（NADPH依赖）的HFA5仅产生0.3 mM，前者生产力是后者的2.8倍；通过整合甲酸脱氢酶(fdh)并敲除adhE优化NADH供给，DAIF菌株NADH/NAD+比从野生型的0.10提高到0.16，细胞内NADH浓度约增加2倍；最终HFNA菌株产生610.8 mg/l ω-羟基棕榈酸和726.6 mg/l游离脂肪酸（C16
- 1 mg/l，C18
- 5 mg/l），ω-羟基棕榈酸产量较未优化NADH的菌株提高约2.8-3倍，为目前摇瓶培养中从葡萄糖合成的最高产量。
研究结论
研究成功构建了从葡萄糖直接合成ω-羟基棕榈酸的大肠杆菌菌株，通过组合脂肪酸合成途径的过表达（Lreu_0335、fabZ）和β-氧化阻断（ΔfadD），以及P450ω-羟化系统（CYP153A+CamAB）和NADH辅因子优化（整合fdh、敲除adhE），最终ω-羟基棕榈酸产量达610.8 mg/l。结果表明脂肪酸合成不是限速步骤，而P450羟化反应及NADH供应是限速因素，为进一步提高羟化脂肪酸产量指明了方向。