An efficient high-throughput screening assay for rapid directed evolution of halohydrin dehalogenase for preparation of β-substituted alcohols
- 作者
- Nan-Wei Wan, Zhi-Qiang Liu, Feng Xue, Kai Huang, Ling-Jiao Tang, Yu-Guo Zheng
- 单位
- Zhejiang University of Technology
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2015）
- DOI
- 10.1007/s00253-015-6527-z
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
天然卤醇脱卤酶（HHDH）的催化活性难以满足工业应用需求，需要定向进化提高其性能，但缺乏简单、灵敏且适用于全细胞的高通量筛选方法。
研究策略
基于叠氮离子与氯化铁形成有色络合物的原理，开发以叠氮消耗量定量HHDH活性的比色法，并进一步建立高通量筛选（HTS）方法；采用该HTS方法筛选HHDH-PL的随机突变文库，结合定点突变组合有益位点，获得高效突变体。
核心内容
本研究针对天然卤醇脱卤酶（HHDH）催化活性难以满足工业应用的问题，开发了一种基于叠氮离子与氯化铁形成有色络合物的新型高通量比色筛选方法。该方法利用叠氮消耗量定量HHDH活性，摩尔消光系数达1.2173×10⁴ L mol⁻¹ cm⁻¹，线性检测范围0–2 mM叠氮，无需特异性底物即可在96孔板上对全细胞直接筛选，同时适用于卤醇和环氧化物底物，有效避免了脱卤过程中质子或卤离子释放的干扰。利用该筛选方法对HHDH-PL随机突变文库中的2500个菌落进行筛选，获得F176M、A187S、A187R三个有益突变，进一步组合后获得双突变体F176M/A187R。纯酶动力学表明，该突变体催化OAE形成乙基(R)-4-氰基-3-羟基丁酸（HN）的kcat/Km达207±3 s⁻¹ mM⁻¹，为野生型的2.8倍，催化效率显著提升且对底物的亲和力明显增强。该研究建立的高通量筛选策略简单、灵敏且底物谱广，为HHDH的快速定向进化提供了高效工具，获得的突变体对β-取代醇的工业制备具有重要应用价值。
创新点
['首次建立了基于叠氮化物消耗的HHDH高通量比色筛选方法，灵敏度高（ε460=1.2173×10^4 L mol−1 cm−1），无需特异性底物，可在96孔板上用全细胞直接筛选。', '该方法同时适用于卤醇和环氧化物底物，避免脱卤过程中释放质子/卤离子的干扰，且不受底物种类限制。', '成功筛选到F176M、A187S、A187R等有益突变，组合突变体F176M/A187R催化效率提高2.8倍。']
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 卤醇脱卤酶催化(S)-CHBE经环氧中间体合成HN（乙基(R)-4-氰基-3-羟基丁酸）的通路 | hhdH-PL (GenBank: ABS64560.1) | 卤醇脱卤酶HHDH-PL | 催化 | 野生型，来源于Parvibaculum lavamentivorans DS-1，用于转化(S)-CHBE制备HN |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 卤醇脱卤酶催化(S)-CHBE经环氧中间体合成HN的通路 | hhdH-PL (F176M) | HHDH-PL F176M | 催化 | 通过随机突变获得的单突变体，HN合成活性较野生型提高2.1倍 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 卤醇脱卤酶催化(S)-CHBE经环氧中间体合成HN的通路 | hhdH-PL (A187R) | HHDH-PL A187R | 催化 | 通过随机突变获得的单突变体，HN合成活性较野生型提高1.8倍 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 卤醇脱卤酶催化(S)-CHBE经环氧中间体合成HN的通路 | hhdH-PL (A187S) | HHDH-PL A187S | 催化 | 通过随机突变获得的单突变体，HN合成活性较野生型提高1.6倍 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 卤醇脱卤酶催化(S)-CHBE经环氧中间体合成HN的通路 | hhdH-PL (F176M/A187R) | HHDH-PL F176M/A187R | 催化 | 通过定点突变组合的有益双突变体，HN合成催化效率较野生型提高2.8倍，为最优突变体 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 卤醇脱卤酶催化(S)-CHBE经环氧中间体合成HN的通路 | hhdH-PL (F176M/A187S) | HHDH-PL F176M/A187S | 催化 | 通过定点突变组合的双突变体，HN合成活性较野生型提高2.3倍 |
关键发现
- 建立的叠氮比色法摩尔吸光系数ε460=1.2173×10^4 L mol−1 cm−1，线性检测范围0–2 mM叠氮
- 筛选2500个菌落，获得3个有益突变F176M、A187S、A187R。野生型HHDH-PL绝对活性为1521 U/mL（粗酶），突变体F176M、A187S、A187R制备HN的相对活性分别提高2.1、1.6、1.8倍
- 双突变F176M/A187S提高2.3倍，F176M/A187R提高3.1倍。纯酶动力学显示，F176M/A187R对OAE形成的kcat/Km为533±10 s−1 mM−1，是野生型（305±6）的1.75倍
- 对HN形成的kcat/Km为207±3 s−1 mM−1，是野生型（74±2）的2.8倍
- Km分别从7.3±0.3 mM降至5.9±0.2 mM（OAE），从10.1±0.1 mM降至5.4±0.2 mM（HN）。
研究结论
本研究开发了一种基于叠氮比色的高通量筛选方法，简单、灵敏、无底物限制，可高效用于HHDH的定向进化；通过该方法筛选并组合有益突变，获得催化效率提高2.8倍的突变体F176M/A187R，可用于高效制备β-取代醇（如HN），对HHDH酶工程和工业应用具有重要意义。