Optimization of recombinant expression enables discovery of novel cytochrome P450 activity in rice diterpenoid biosynthesis
- 作者
- Naoki Kitaoka, Yisheng Wu, Meimei Xu, Reuben J. Peters
- 单位
- Department of Biochemistry, Biophysics, and Molecular Biology, Iowa State University, Ames, IA 50011, USA; Tohoku University, Sendai 980-8577, Japan; Conagen Inc., Bedford, MA 01730, USA
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2015）
- DOI
- 10.1007/s00253-015-6496-2
- 所属领域
- 代谢工程/合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
水稻二萜类生物合成中的细胞色素P450（CYP）酶由于膜结合特性难以在大肠杆菌中重组表达，导致部分同源基因（如CYP99A2、CYP701A9）功能无法表征，且已有CYP的催化活性未充分解析。
研究策略
通过优化重组表达系统，包括选择pET-Duet载体、调整Shine-Dalgarno序列间距、利用Gateway DEST cassette进行亚克隆，以及结合合成基因密码子优化和N端修饰，实现在大肠杆菌中功能性表达水稻CYP，并利用代谢工程系统重建二萜生物合成通路以筛选和鉴定新活性。
研究路线图
核心内容
针对水稻二萜生物合成中膜结合型细胞色素P450酶难以在大肠杆菌中功能表达的问题，该研究系统优化了重组表达系统，包括采用pET-Duet载体、调整Shine-Dalgarno序列间距、利用Gateway DEST cassette进行亚克隆，并结合密码子优化与N端修饰，成功实现了多个P450酶的可溶性活性表达。借助在大肠杆菌中重建二萜合成通路，研究表征了此前无法解析的CYP99A2活性，其催化活性较优化前提高至少30倍，动力学参数为KM=1.2 μM，kcat=8.3 s⁻¹；同时鉴定了三个新催化功能：CYP701A8催化syn-pimaradiene的3β-羟基化，CYP71Z6和CYP71Z7分别介导ent-isokaurene和ent-cassadiene的多步氧化，生成含二羟基或酮基的氧化产物，且转化率大幅提升，含氧二萜占比超过50%。这些发现完善了momilactone、phytocassane等植保素生物合成途径的氧化步骤，证实优化重组表达策略是发掘植物P450新功能的可行途径。
创新点
1. 优化载体和亚克隆策略，解决了多个CYP（CYP99A2、CYP701A9）的功能表达问题；2. 发现CYP701A8催化syn-pimaradiene的3β-羟基化，与momilactone生物合成相关；3. 发现CYP71Z6和CYP71Z7具有多步氧化活性，分别生成2α,3α-二羟基-ent-isokaurene和3α-羟基-ent-cassadien-2-酮；4. 通过规模化培养和NMR鉴定了新产物结构。
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 水稻二萜类生物合成（momilactone途径） | CYP99A2 | CYP99A2 | 催化 | 催化syn-pimaradiene的C19氧化，生成syn-pimaradien-19-醇/醛/酸；与CYP99A3功能冗余，但表达水平更高。 |
| Escherichia coli | 水稻二萜类生物合成（momilactone途径） | CYP99A3 | CYP99A3 | 催化 | 已知的syn-pimaradiene C19氧化酶，作为对照，动力学参数用于比较。 |
| Escherichia coli | 水稻二萜类生物合成（momilactone途径） | CYP701A8 | CYP701A8 | 催化 | 新发现催化syn-pimaradiene的C3β-羟基化，生成syn-pimaradien-3β-醇；对ent-CPP来源的二萜则催化C3α-羟基化。 |
| Escherichia coli | 水稻二萜类生物合成 | CYP701A9 | CYP701A9 | 催化 | 与CYP701A8高度同源（79% identity），但未检测到有效活性，可能正在假基因化。 |
| Escherichia coli | 水稻二萜类生物合成（oryzadione/oryzadiene途径） | CYP71Z6 | CYP71Z6 | 催化 | 催化ent-isokaurene的2α-羟基化及进一步3α-羟基化，生成2α,3α-二羟基-ent-isokaurene。 |
| Escherichia coli | 水稻二萜类生物合成（phytocassane途径） | CYP71Z7 | CYP71Z7 | 催化 | 催化ent-cassadiene的2α-羟基化、2-酮氧化及3α-羟基化，生成3α-羟基-ent-cassadien-2-酮。 |
| Escherichia coli | 水稻二萜类生物合成（syn-pimaradiene合成） | OsKSL4 | OsKSL4 | 催化 | I类二萜合酶，催化syn-CPP生成syn-pimaradiene，用于底物供应。 |
| Escherichia coli | 水稻二萜类生物合成（ent-isokaurene合成） | OsKSL6 | OsKSL6 | 催化 | I类二萜合酶，催化ent-CPP生成ent-isokaurene。 |
| Escherichia coli | 水稻二萜类生物合成（ent-cassadiene合成） | OsKSL7 | OsKSL7 | 催化 | I类二萜合酶，催化ent-CPP生成ent-cassadiene。 |
| Escherichia coli | 电子传递链（P450还原） | AtCPR1 | AtCPR1（拟南芥NADPH:细胞色素P450还原酶） | 催化 | 为CYP提供电子，与水稻CYP配对良好，用于重组共表达。 |
关键发现
- 优化表达后，CYP99A2活性较之前提高至少30倍，其催化syn-pimaradiene生成syn-pimaradien-19-醇、醛和酸，动力学常数：KM=1.2±0.1 μM，kcat=8.3±0.1 s⁻¹，kcat/KM=7.0 s⁻¹ μM⁻¹
- CYP99A3的KM=2.0±0.5 μM，kcat=46±2 s⁻¹，kcat/KM=23 s⁻¹ μM⁻¹
- CYP701A8催化syn-pimaradiene生成syn-pimaradien-3β-醇，KM=27±6 μM，kcat=1.4±0.1 s⁻¹，kcat/KM=5.2×10⁻² s⁻¹ μM⁻¹
- CYP71Z6催化ent-isokaurene生成2α-羟基-ent-isokaurene及2α,3α-二羟基-ent-isokaurene
- CYP71Z7催化ent-cassadiene生成ent-cassadien-2-酮、2α-羟基-ent-cassadiene及3α-羟基-ent-cassadien-2-酮
- CYP71Z6/7的底物转化率大幅提高，氧化产物成为主要产物（含氧二萜占比超过50%）。
研究结论
通过优化重组表达系统，成功表征了先前难以表达的水稻CYP（CYP99A2和CYP701A9），并发现了CYP701A8、CYP71Z6和CYP71Z7的新活性。这些结果完善了水稻二萜类植保素（如momilactone、phytocassane和oryzadione）生物合成途径中的氧化步骤，表明优化表达策略是发现CYP新功能的有效手段。