Metabolic engineering of Clostridium tyrobutyricum for \(n\) -butanol production from maltose and soluble starch by overexpressing \(\alpha\) -glucosidase
- 作者
- Le Yu, Mengmeng Xu, I-Ching Tang, Shang-Tian Yang
- 单位
- William G. Lowrie Department of Chemical and Biomolecular Engineering, The Ohio State University, 151 West Woodruff Ave, Columbus, OH 43210, USA; Bioprocessing Innovative Company, 4734 Bridle Path Ct, Dublin, OH 43017, USA
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2015）
- DOI
- 10.1007/s00253-015-6680-4
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
Clostridium tyrobutyricum缺乏利用麦芽糖和淀粉的酶系统，无法直接利用这些廉价碳源生产丁醇。
研究策略
从Clostridium acetobutylicum ATCC 824中克隆两个α-葡萄糖苷酶基因（agluI和agluII），与adhE2一同在C. tyrobutyricum（Δack）中共表达，使其能够水解麦芽糖和可溶性淀粉并高效生产丁醇；通过pH优化和无抗生素自选择实现稳定发酵。
核心内容
研究人员从丙酮丁醇梭菌ATCC 824中克隆了两个α-葡萄糖苷酶基因agluI和agluII，与adhE2一同在敲除ack的酪丁酸梭菌中共表达，使其首次具备直接利用麦芽糖和可溶性淀粉产丁醇的能力。表达agluI的突变株以麦芽糖为碳源时丁醇产量达17.2 g/L，显著高于亲本株利用葡萄糖的9.5 g/L，产率从0.10 g/g提升至0.20 g/g，生产速率从0.16 g/L·h提高到0.29 g/L·h；利用可溶性淀粉时产丁醇16.2 g/L，优于对照菌株的8.8 g/L。AgluI酶活在pH 5.5时比AgluII高约60%，且pH显著影响其活性。利用麦芽糖作为天然选择压力，该菌株在无抗生素条件下约45小时内产生17.3 g/L丁醇，生产速率达0.40 g/L·h，质粒稳定率达99.8%。该策略使酪丁酸梭菌在丁醇滴度、产率和速率上均超越传统生产菌株，且无需抗生素维持遗传稳定，为低成本利用纤维质原料的工业丁醇发酵提供了可行方案。
创新点
['首次在C. tyrobutyricum中实现麦芽糖和可溶性淀粉的直接利用', '首次成功将胞外α-葡萄糖苷酶基因在两个不同梭菌物种间转移', '利用麦芽糖作为天然选择压力，实现无抗生素的稳定发酵', '通过组成型表达避免C. acetobutylicum中葡萄糖对淀粉水解酶的分解代谢物阻遏']
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755 (Δack) | 丁醇合成途径 | adhE2 | AdhE2 | 催化 | 来自C. acetobutylicum ATCC 824的双功能醛/醇脱氢酶，催化丁酰-CoA和乙酰-CoA还原为丁醇和乙醇 |
| Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755 (Δack) | 麦芽糖/淀粉水解途径 | agluI (CAC2891) | AgluI | 催化 | 胞外α-葡萄糖苷酶，水解α-1,4糖苷键，从非还原端释放葡萄糖，锚定于细胞膜 |
| Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755 (Δack) | 麦芽糖/淀粉水解途径 | agluII (CAC2252) | AgluII | 催化 | 胞外α-葡萄糖苷酶，与AgluI类似但酶活性低约60%，也锚定于细胞膜 |
| Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755 (Δack) | 丁酸/丁醇发酵途径 | ack | — | 调控 | 敲除乙酸激酶基因，减少乙酸生成，使碳流向丁醇前体丁酰-CoA |
关键发现
表达agluI的突变株Ct(Δack)-pGluI利用麦芽糖产丁醇17.2 g/L（亲本株Ct(Δack)-pM2利用葡萄糖仅9.5 g/L），丁醇产率0.20 g/g（对比0.10 g/g），生产速率0.29 g/L h（对比0.16 g/L h）。利用可溶性淀粉时，Ct(Δack)-pGluI产丁醇16.2 g/L（Cac 824仅8.8 g/L），产率0.17 g/g，速率0.20 g/L h。无抗生素条件下，Ct(Δack)-pGluI在约45 h内产生17.3 g/L丁醇，生产速率达0.40 g/L h。AgluI酶活在pH5.5时比AgluII高约60%（32.7 vs 20.5 nmol PNP/mL/min），且受pH影响，pH5.0时48.0，pH6.5时降为7.4。pGluI质粒在葡萄糖上稳定率99.5%，麦芽糖上99.8%。Cac 824利用麦芽糖产丁醇11.2 g/L伴丙酮8.8 g/L，利用淀粉产丁醇8.8 g/L伴丙酮6.0 g/L。
研究结论
通过表达异源α-葡萄糖苷酶（AgluI）及AdhE2，C. tyrobutyricum突变株可高效利用麦芽糖和可溶性淀粉生产丁醇，其丁醇滴度、产率和生产速率均优于C. acetobutylicum ATCC 824，且无需抗生素即可保持遗传稳定，适用于低成本纤维质原料的工业丁醇发酵。