Physiologo-biochemical characteristics of citrate-producing yeast Yarrowia lipolytica grown on glycerol-containing waste of biodiesel industry
- 作者
- Igor G. Morgunov, Svetlana V. Kamzolova
- 单位
- Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Russian Academy of Sciences, Pushchino, Russia
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2015）
- DOI
- 10.1007/s00253-015-6558-5
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
阐明解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）利用生物柴油工业含甘油废料（GW）生产柠檬酸（CA）的生理生化机制，特别是甘油与脂肪酸的代谢途径，以开发高效柠檬酸生产工艺。
研究策略
通过分析Y. lipolytica野生菌株VKM Y-2373和突变菌株NG40/UV7在GW上的生长动态、甘油和脂肪酸消耗规律以及相关酶活变化，比较两菌株的柠檬酸生产性能，优化GW补料策略。
研究路线图
核心内容
该研究以解脂耶氏酵母野生株VKM Y-2373及其突变株NG40/UV7为对象，系统考察了二者在生物柴油工业含甘油废料上的生长与柠檬酸合成特性。通过分析甘油和脂肪酸消耗规律及糖酵解、三羧酸循环关键酶活变化，发现两菌株可同时利用废料中的甘油与脂肪酸，且甘油不抑制脂肪酸代谢，氮源限制条件是触发柠檬酸积累的关键。补料发酵中，野生株产柠檬酸67.7 g/L，柠檬酸与异柠檬酸比值为1.7:1；突变株则因乌头酸水合酶活性极低（仅20 nmol/min·mg蛋白）且NAD-异柠檬酸脱氢酶显著下调，同时柠檬酸合酶活性高达1600 nmol/min·mg蛋白，柠檬酸产量达122.2 g/L，比值高达53:1，产率0.95 g/g，体积生产率0.99 g/L/h。结果表明，突变株通过阻断柠檬酸向下游转化实现了碳流高效定向积累，该菌株利用含甘油废料生产柠檬酸具备良好工业应用潜力。
创新点
首次揭示了Y. lipolytica可同时利用GW中的甘油和脂肪酸，且甘油不抑制脂肪酸代谢；通过突变株NG40/UV7实现高柠檬酸产量（122.2 g/L）和极高的CA/ICA比（53:1）。
研究对象（16）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Yarrowia lipolytica VKM Y-2373 / NG40/UV7 | 甘油代谢 | — | 甘油激酶（Glycerol kinase） | 催化 | 参与甘油磷酸化，两菌株中均有活性，对数期约105-170 nmol/(min·mg protein) |
| Yarrowia lipolytica VKM Y-2373 / NG40/UV7 | 甘油代谢 | — | NAD-甘油-3-磷酸脱氢酶（NAD-dependent glycerol-3-phosphate dehydrogenase） | 催化 | 活性随培养时间降低，从68降至34 nmol/(min·mg protein) |
| Yarrowia lipolytica VKM Y-2373 / NG40/UV7 | 甘油代谢 | — | FAD-甘油-3-磷酸脱氢酶（FAD-dependent glycerol-3-phosphate dehydrogenase） | 催化 | 活性随培养时间升高，从55升至82 nmol/(min·mg protein) |
| Yarrowia lipolytica VKM Y-2373 / NG40/UV7 | 糖酵解 | — | 甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase） | 催化 | 活性维持在120-130 nmol/(min·mg protein) |
| Yarrowia lipolytica VKM Y-2373 / NG40/UV7 | 糖酵解 | — | 丙酮酸激酶（Pyruvate kinase） | 催化 | 活性从305降至270 nmol/(min·mg protein) |
| Yarrowia lipolytica VKM Y-2373 / NG40/UV7 | 丙酮酸代谢 | — | 丙酮酸脱氢酶（Pyruvate dehydrogenase） | 催化 | 活性83-130 nmol/(min·mg protein) |
| Yarrowia lipolytica VKM Y-2373 / NG40/UV7 | 三羧酸循环 / 乙醛酸循环 | — | 柠檬酸合酶（Citrate synthase） | 催化 | 活性高，1460-2000 nmol/(min·mg protein)；突变株约1600 |
| Yarrowia lipolytica VKM Y-2373 / NG40/UV7 | 三羧酸循环 | — | 乌头酸水合酶（Aconitate hydratase） | 催化 | 野生型对数期330，稳定期94；突变株对数期120，稳定期20 nmol/(min·mg protein) |
| Yarrowia lipolytica VKM Y-2373 / NG40/UV7 | 三羧酸循环 | — | NAD-异柠檬酸脱氢酶（NAD-dependent isocitrate dehydrogenase） | 催化 | 野生型对数期80，稳定期20；突变株对数期90，稳定期约10 nmol/(min·mg protein) |
| Yarrowia lipolytica VKM Y-2373 / NG40/UV7 | 三羧酸循环 | — | NADP-异柠檬酸脱氢酶（NADP-dependent isocitrate dehydrogenase） | 催化 | 野生型活性250-300，突变株约80-90 nmol/(min·mg protein) |
| Yarrowia lipolytica VKM Y-2373 / NG40/UV7 | 乙醛酸循环 | — | 异柠檬酸裂解酶（Isocitrate lyase） | 催化 | 野生型110-135，突变株约89-90 nmol/(min·mg protein) |
| Yarrowia lipolytica VKM Y-2373 / NG40/UV7 | 乙醛酸循环 | — | 苹果酸合酶（Malate synthase） | 催化 | 野生型活性57-70 nmol/(min·mg protein) |
| Yarrowia lipolytica VKM Y-2373 / NG40/UV7 | 三羧酸循环 | — | α-酮戊二酸脱氢酶（Oxoglutarate dehydrogenase） | 催化 | 活性20-40 nmol/(min·mg protein) |
| Yarrowia lipolytica VKM Y-2373 / NG40/UV7 | 三羧酸循环 | — | 琥珀酸脱氢酶（Succinate dehydrogenase） | 催化 | 活性180-260 nmol/(min·mg protein) |
| Yarrowia lipolytica VKM Y-2373 / NG40/UV7 | 三羧酸循环 | — | 延胡索酸水合酶（Fumarate hydratase） | 催化 | 活性280-300 nmol/(min·mg protein) |
| Yarrowia lipolytica VKM Y-2373 / NG40/UV7 | 三羧酸循环 | — | 苹果酸脱氢酶（Malate dehydrogenase） | 催化 | 活性1800-2100 nmol/(min·mg protein) |
关键发现
- 在GW（20 g/L）培养中，Y. lipolytica VKM Y-2373同时消耗甘油和脂肪酸，甘油摄取速率0.70-0.78 g/L/h，脂肪酸0.2-0.25 g/L/h，最大比生长速率0.352 h^-1，生物量21.0 g/L，生物量得率1.05 g/g。在氮源限制下进行补料发酵，野生型VKM Y-2373产CA
- 7 g/L、ICA
- 4 g/L，CA:ICA=1.7:1，CA产率0.59 g/g，体积生产率0.55 g/L/h；突变株NG40/UV7产CA
- 2 g/L、ICA
- 3 g/L，CA:ICA=53:1，CA产率0.95 g/g，体积生产率0.99 g/L/h。酶活测定显示，突变株柠檬酸合酶活性高达1600 nmol/(min·mg protein)，而乌头酸水合酶活性仅20 nmol/(min·mg protein)，NAD-异柠檬酸脱氢酶活性也显著降低，这与CA/ICA高比例相关。
研究结论
Y. lipolytica能同时利用GW中的甘油和脂肪酸，通过氮源限制可高效生产柠檬酸。突变株NG40/UV7因乌头酸水合酶和NAD-异柠檬酸脱氢酶活性低，主要积累柠檬酸，CA产量122.2 g/L，CA:ICA=53:1，产率0.95 g/g，具有工业应用潜力。