Adaptive laboratory evolution of ethanologenic Zymomonas mobilis strain tolerant to furfural and acetic acid inhibitors
- 作者
- Zong-Xia Shui, Han Qin, Bo Wu, Zhi-yong Ruan, Lu-shang Wang, Fu-Rong Tan, Jing-Li Wang, Xiao-Yu Tang, Li-Chun Dai, Guo-Quan Hu, Ming-Xiong He
- DOI
- 10.1007/s00253-015-6616-z
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
木质纤维素水解液中的糠醛和乙酸是抑制运动发酵单胞菌乙醇生产的主要抑制剂，但由于其分子机制不明，通过理性工程改造获得耐受菌株十分困难。
研究策略
采用适应性实验室进化（ALE）策略，在逐步提高糠醛（1→3 g/l）和乙酸（4→7 g/l）浓度的培养基中进行连续传代筛选，获得耐受突变株。
核心内容
针对木质纤维素水解液中糠醛和乙酸严重抑制运动发酵单胞菌乙醇生产且耐受机制不明的问题，该研究采用适应性实验室进化策略，在逐步提高糠醛（1至3 g/L）和乙酸（4至7 g/L）浓度的培养基中连续传代筛选。经三轮进化，获得ZMA7-2和ZMF3-3等四个耐受突变株。ZMA7-2在7 g/L乙酸胁迫下18小时细胞密度为0.67，较野生型ZM4提高2.64倍；ZMF3-3在3 g/L糠醛胁迫下细胞密度为0.532，最高OD600达3.023，葡萄糖利用显著加快，理论乙醇产率达94.84%，而ZM4仅为9.89%。酶活测定显示，ZMF3-3在糠醛胁迫下乙醇脱氢酶（ADH）活性为54.2 U/g，较ZM4提高5.54倍，ZMA7-2在乙酸胁迫下ADH活性也提升了43.7%。结果表明ALE能有效改善运动发酵单胞菌对抑制物的耐受性，获得的突变株可作为后续代谢工程改造和耐受机制研究的优良宿主。
创新点
首次报道获得可耐受较高糠醛（3 g/l）的运动发酵单胞菌菌株；将 ALE 应用于该菌株并成功提高其糠醛和乙酸耐受性；获得的菌株可作为后续代谢工程宿主和耐受机制研究模型。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Zymomonas mobilis ZM4 | Entner-Doudoroff (ED) pathway | pdc | pyruvate decarboxylase (PDC) | 催化 | 糠醛和乙酸胁迫下活性降低，进化菌株 ZMF3-3 在糠醛胁迫下 PDC 活性较野生型提高 46.4% |
| Zymomonas mobilis ZM4 | Entner-Doudoroff (ED) pathway | adh | alcohol dehydrogenase (ADH) | 催化 | 糠醛对 ADH 活性抑制作用更强；ZMA7-2 在乙酸胁迫下 ADH 活性较野生型提高 43.7%，ZMF3-3 在糠醛胁迫下提高 5.54 倍 |
关键发现
- 通过三轮适应性实验室进化，获得四个耐受突变株 ZMA7-2、ZMA7-3、ZMF3-2、ZMF3-3。其中 ZMA7-2 在 7 g/l 乙酸胁迫下 18 h 细胞密度为
- 67（ZM4 为
- 184，提高
- 64 倍）；ZMF3-3 在 3 g/l 糠醛胁迫下 18 h 细胞密度为
- 532（ZM4 为
- 164，提高
- 24 倍），最高 OD600 达
- 023。最佳菌株 ZMF3-3 在 3 g/l 糠醛胁迫下葡萄糖利用显著加快，理论乙醇产率达
- 84%，而 ZM4 仅为
- 89%（乙醇产率下降
- 8%）。酶活测定显示，ZMF3-3 在糠醛胁迫下 PDC 活性为
- 8 U/g（ZM4 为
- 9 U/g），ADH 活性为
- 2 U/g（ZM4 为
- 8 U/g，提高
- 54 倍）；ZMA7-2 在乙酸胁迫下 ADH 活性为
- 9 U/g（ZM4 为
- 52 U/g，提高
- 7%）。
研究结论
通过 ALE 成功筛选出乙酸和糠醛耐受的运动发酵单胞菌突变株 ZMA7-2 和 ZMF3-3，其中 ZMF3-3 在 3 g/l 糠醛下理论乙醇产率达 94.84%，远高于野生型；表明 ALE 是改善运动发酵单胞菌抑制物耐受性的有效工具。