Metabolic engineering of Escherichia coli to enhance acetol production from glycerol
- 作者
- Ruilian Yao, Qing Liu, Hongbo Hu, Thomas K. Wood, Xuehong Zhang
- 单位
- Key Laboratory of Microbial Metabolism, School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China; Department of Chemical Engineering, Pennsylvania State University, University Park, PA 16802-4400, USA
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2015）
- DOI
- 10.1007/s00253-015-6732-9
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
大肠杆菌利用甘油生产羟基丙酮（acetol）时，甘油消耗速率低且NADPH供应不足，导致产量偏低。需要代谢工程改造以提高甘油利用率和NADPH可用性。
研究策略
通过替换甘油激酶基因glpK为来自Lin43的glpK22等位基因解除变构抑制，提高甘油消耗；添加葡萄糖作为共底物并通过敲除ptsG解除碳代谢物阻遏、促进葡萄糖与甘油共利用以增强NADPH供应；进一步利用反义RNA沉默gapA，将糖酵解碳流导向氧化性磷酸戊糖途径，提升NADPH水平。
核心内容
该研究通过组合代谢工程策略系统改造大肠杆菌，以增强其利用甘油合成羟基丙酮（acetol）的能力。首先将甘油激酶基因glpK替换为来自Lin43的glpK22等位基因，解除变构抑制，使acetol产量较对照提高5.5倍至0.44 g/L，甘油消耗速率提升53.4%。随后添加葡萄糖作为共底物，并敲除ptsG解除碳代谢物阻遏，促进双底物同步利用，使NADPH水平提高1.72倍，acetol产量增至1.20 g/L。进一步利用反义RNA部分沉默糖酵解关键基因gapA，将碳流导向氧化性磷酸戊糖途径，使gapA转录下调6.9倍、zwf上调2.2倍，NADPH水平较HJ02提高72.4%。最终菌株HJ05的acetol产量达1.82 g/L，为初始菌株HJ02的2.1倍，甘油产率达0.25 g/g，较对照提高2.8倍。该研究表明，增强甘油利用效率与NADPH供应是提升acetol生产的关键瓶颈，组合改造策略为微生物利用廉价底物合成高附加值化学品提供了可行思路。
创新点
采用glpK22等位基因替换提高甘油利用及甲基乙二醛供给；敲除ptsG使葡萄糖和甘油同步利用、提高NADPH利用效率；利用反义RNA部分沉默gapA（而非完全敲除）以避免生长缺陷，同时实现磷酸戊糖途径循环化，显著增强NADPH生成。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BW25113 | 甘油代谢 | glpK | GlpK (甘油激酶) | 催化 | 野生型，受FBP和EIIA^Glc变构抑制，在HJ02中替换为glpK22 |
| Escherichia coli HJ02 | 甘油代谢 | glpK22 | GlpK (G304S突变) | 催化 | 来自Lin43，对FBP和EIIA^Glc不敏感，提高甘油消耗速率 |
| Escherichia coli BW25113衍生菌株 | 甲基乙二醛还原/acetol合成 | yqhD | YqhD (醛氧化还原酶) | 催化 | 过表达，将甲基乙二醛还原为acetol，利用NADPH |
| Escherichia coli HJ02 | 甲基乙二醛合成（甘油代谢分支） | mgsA | MgsA (甲基乙二醛合酶) | 催化 | 将DHAP转化为甲基乙二醛，其转录水平在HJ02中上调2.5倍 |
| Escherichia coli HJ04 | 葡萄糖转运/磷酸转移酶系统 | ptsG | EIICB^Glc | 转运 | 敲除ptsG解除碳代谢物阻遏，使葡萄糖和甘油同步利用 |
| Escherichia coli HJ05 | 糖酵解（甘油醛-3-磷酸脱氢） | gapA | GapA (甘油醛-3-磷酸脱氢酶) | 催化 | 通过反义RNA沉默，转录水平下调6.9倍，将碳流导向磷酸戊糖途径 |
| Escherichia coli HJ05 | 氧化性磷酸戊糖途径 | zwf | Zwf (葡萄糖-6-磷酸脱氢酶) | 催化 | 转录水平受诱导上调，在添加葡萄糖时表达增强，在HJ05中上调2.2倍 |
关键发现
- 与对照HJ01相比，替换glpK的HJ02使acetol产量提高5.5倍（从0.08 g/L升至0.44 g/L），甘油消耗速率提高53.4%。添加葡萄糖使HJ02的acetol浓度提高61%至0.71 g/L，NADPH水平提高1.72倍、NADPH/NADP+提高1.43倍。进一步敲除ptsG（HJ04）使acetol产量达1.20 g/L（比HJ02高69.0%），甘油产率提高2.5倍，NADPH水平和NADPH/NADP+均提高约30%。沉默gapA（HJ05）后acetol浓度最高达1.82 g/L，是HJ02的2.1倍、HJ04的1.5倍，甘油产率达0.25 g/g，较HJ02提高2.8倍
- gapA转录水平下调6.9倍，zwf上调2.2倍，NADPH水平比HJ02高72.4%、比HJ04高32.3%。实时PCR证实HJ05中葡萄糖分解代谢从糖酵解重定向至氧化性磷酸戊糖途径。
研究结论
通过组合改造（glpK替换、葡萄糖共底物、ptsG敲除、gapA沉默）可显著提高大肠杆菌利用甘油合成acetol的能力，最高产量1.82 g/L，表明增强甘油利用和NADPH供应是提升acetol生产的关键。