Improving furfural tolerance of Zymomonas mobilis by rewiring a sigma factor RpoD protein
- 作者
- Fu-Rong Tan, Li-Chun Dai, Bo Wu, Han Qin, Zong-Xia Shui, Jing-Li Wang, Qi-Li Zhu, Qi-Chun Hu, Zhi-Yong Ruan, Ming-Xiong He
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2015）
- DOI
- 10.1007/s00253-015-6577-2
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
木质纤维素水解液中的糠醛是生物乙醇发酵的关键抑制剂，严重抑制运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）的生长和乙醇生产，需要有效提高其糠醛耐受性。
研究策略
通过易错PCR对编码全局转录sigma因子σ70的rpoD基因进行随机突变，构建突变文库，在含有1~3 g/L糠醛的培养基中连续富集筛选，获得耐受性提高的突变株，并对最佳突变株进行生长、葡萄糖消耗、乙醇产量、关键酶活性和qRT-PCR基因表达分析。
核心内容
该研究采用全局转录机器工程策略，对运动发酵单胞菌ZM4的sigma因子RpoD蛋白进行易错PCR随机突变，在含1~3 g/L糠醛的培养基中连续富集筛选，获得三个耐受性提高的突变株ZM4-MF1、ZM4-MF2和ZM4-MF3。其中最佳突变株ZM4-MF2在3 g/L糠醛胁迫下最大细胞密度OD600约2.0，显著高于对照的1.3；24小时时残留葡萄糖约22%，对照为58%，乙醇产量达9.8 g/L，较对照的6.9 g/L提高约42%。机制分析表明，ZM4-MF2的丙酮酸脱羧酶活性在24小时和48小时分别为对照的4.6倍和3.1倍，qRT-PCR结果显示pdc基因上调11.8倍、编码醛酮还原酶的xylR上调15.83倍，而glk、edd、coQ7和dsbB等基因不同程度下调。该研究首次将全局转录机器工程应用于Z. mobilis，通过改造全局调控因子而非单一基因实现多基因协同响应，有效提升了菌株的糠醛耐受性和乙醇发酵性能，为工业菌株胁迫耐受性改良提供了可行工具。
创新点
首次报道利用全局转录机器工程（global transcription machinery engineering）策略改造Z. mobilis的sigma因子RpoD蛋白以提高糠醛耐受性；通过改变全局调控因子而非单一基因操作，实现多基因协同响应，改善细胞在糠醛胁迫下的生长和乙醇发酵性能。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Zymomonas mobilis ZM4 | 全局转录调控 | rpoD | RpoD (σ70) | 调控 | 通过易错PCR引入突变，改变RNA聚合酶启动子选择性，全局调节转录 |
| Zymomonas mobilis ZM4 | Entner-Doudoroff (ED) pathway / 乙醇发酵 | pdc | 丙酮酸脱羧酶 | 催化 | 糠醛胁迫下在ZM4-MF2中表达上调11.8倍，酶活显著提高 |
| Zymomonas mobilis ZM4 | Entner-Doudoroff (ED) pathway / 乙醇发酵 | adh | 乙醇脱氢酶 | 催化 | 糠醛胁迫下表达上调1.86倍，酶活在48 h显著高于对照 |
| Zymomonas mobilis ZM4 | Entner-Doudoroff (ED) pathway | glk | 葡萄糖激酶 | 催化 | 糠醛胁迫下表达下调1.731倍 |
| Zymomonas mobilis ZM4 | Entner-Doudoroff (ED) pathway | edd | 6-磷酸葡萄糖酸脱水酶 | 催化 | 糠醛胁迫下表达下调1.439倍 |
| Zymomonas mobilis ZM4 | 糠醛代谢 / 木糖还原 | xylR | 醛酮还原酶（醛糖还原酶） | 催化 | ZMO0976，糠醛胁迫下在ZM4-MF2中表达上调15.83倍，可能参与糠醛解毒 |
| Zymomonas mobilis ZM4 | 硫酸盐转运 | sulP | 硫酸盐转运蛋白 | 转运 | 糠醛胁迫下表达略有上调（1.191倍） |
| Zymomonas mobilis ZM4 | 泛醌生物合成 | coQ7 | 泛醌生物合成蛋白COQ7 | 催化 | 糠醛胁迫下表达下调2.147倍 |
| Zymomonas mobilis ZM4 | 二硫键形成 | dsbB | 二硫键形成蛋白DsbB | 催化 | 糠醛胁迫下表达下调3.03倍 |
关键发现
- 从易错PCR文库中筛选到三个RpoD突变株（ZM4-MF1、ZM4-MF2、ZM4-MF3），在3 g/L糠醛下，最佳突变株ZM4-MF2最大细胞密度OD600约2.0（约30 h），而对照ZM4-rpoD仅约1.3
- 24 h时ZM4-MF2残留葡萄糖约22%，对照约58%
- 54 h时残留葡萄糖分别为7.2%和25%，乙醇产量分别为9.8 g/L和6.9 g/L
- ZM4-MF2的PDC酶活在24 h和48 h分别为对照的4.6倍和3.1倍
- qRT-PCR显示pdc上调11.8倍、adh上调1.86倍、xylR（ZMO0976）上调15.83倍，而glk下调1.731倍、edd下调1.439倍、coQ7下调2.147倍、dsbB下调3.03倍。
研究结论
通过改造全局转录因子RpoD蛋白能够有效提高Z. mobilis的糠醛耐受性和乙醇产量，表明全局转录机器工程可作为改善工业菌株胁迫耐受性的有效工具。