Enhanced production of leech hyaluronidase by optimizing secretion and cultivation in Pichia pastoris
- 作者
- Zhen Kang, Na Zhang, Yunfeng Zhang
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2015）
- DOI
- 10.1007/s00253-015-7056-5
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
水蛭透明质酸酶（LHAase）在毕赤酵母中分泌表达水平不足，需要提高其产量以满足工业生产需求。
研究策略
通过N端工程（替换信号肽、融合两亲肽）结合培养温度优化（变温控制策略）来提升LHAase的分泌表达水平和酶学性能。
核心内容
该研究以毕赤酵母为宿主，通过N端工程结合培养温度优化策略，系统提升水蛭透明质酸酶（LHAase）的分泌表达水平。研究者比较了四种信号肽和六种两亲肽的促分泌效果，发现nsB信号肽和AP2两亲肽效果最佳。替换nsB信号肽后，摇瓶酶活较α-因子信号肽提高126%，达7.96×10^4 U/ml，发酵产量达1.03×10^6 U/ml。融合AP2两亲肽后，比活从1.23×10^6 U/mg提升至1.44×10^6 U/mg，催化效率kcat/Km从508提高至841，同时最适温度升至50°C，热稳定性范围拓宽至20-60°C。在诱导温度优化中，22°C比25°C和30°C产量分别高126%和342%。进一步采用两阶段变温策略（25°C转22°C）后，最终产量达1.68×10^6 U/ml，生产率为1.87×10^4 U/ml/h，为当时报道的最高水平。该研究证明N端工程与变温控制的协同策略可显著改善酶分泌效率和酶学性能，为透明质酸寡糖的工业化生产提供了高效酶源。
创新点
系统比较了四种信号肽和六种两亲肽，发现nsB信号肽和AP2两亲肽能显著提高LHAase产量和比活；引入两阶段变温控制策略，进一步提高发酵产量。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pichia pastoris GS115 | 透明质酸降解 | LHAase | 水蛭透明质酸酶 | 催化 | 靶标酶，初始产量8.42×10^5 U/ml，最终提升至1.68×10^6 U/ml |
| Pichia pastoris GS115 | 分泌途径 | nsB | nsB信号肽 | 转运 | 来源于Candida antarctica lipase B的天然信号肽，替代α-因子信号肽后酶活提高126% |
| Pichia pastoris GS115 | 分泌途径 | YTP1 | YTP1信号肽 | 转运 | 来源于S. cerevisiae，分泌效率低于α-因子 |
| Pichia pastoris GS115 | 分泌途径 | SCS3 | SCS3信号肽 | 转运 | 来源于S. cerevisiae，分泌效率低于α-因子 |
| Pichia pastoris GS115 | 分泌途径 | HKR1 | HKR1信号肽 | 转运 | 来源于S. cerevisiae，分泌效率低于α-因子 |
| Pichia pastoris GS115 | N端融合 | AP2 | AP2两亲肽 | 调控 | 16个氨基酸的两亲肽，融合后比活提高至1.44×10^6 U/mg，最适pH降至5.0，最适温度升至50°C，热稳定性拓宽至20-60°C |
| Pichia pastoris GS115 | 甲醇代谢 | — | 醇氧化酶（AOX） | 能量供给 | 甲醇诱导表达的关键酶，低诱导温度下AOX活性更高，与细胞活力正相关 |
关键发现
- 初始LHAase产量为8.42×10^5 U/ml
- 替换nsB信号肽后摇瓶酶活达7.96×10^4 U/ml（比α-因子信号肽提高126%），发酵产量达1.03×10^6 U/ml
- 融合AP2两亲肽后比活从1.23×10^6 U/mg提高至1.44×10^6 U/mg，kcat/Km从508提高到841，最适pH从6.5降至5.0，最适温度从45°C升至50°C，热稳定性范围从20-55°C拓宽至20-60°C
- 诱导温度优化中22°C比25°C和30°C产量分别高126%和342%，发酵产量达1.48×10^6 U/ml
- 结合两阶段变温（25°C转22°C）策略后，最终产量达1.68×10^6 U/ml，生产率为1.87×10^4 U/ml/h，为迄今报道的最高水平。
研究结论
通过N端工程（nsB信号肽和AP2两亲肽）与变温培养策略相结合，LHAase在毕赤酵母中的产量提升至1.68×10^6 U/ml，且酶的热稳定性和催化效率得到改善，为透明质酸寡糖的工业化生产提供了高效酶源。