Metabolic engineering of Bacillus subtilis for terpenoid production
- 作者
- Zheng Guan, Dan Xue, Ingy I. Abdallah, Linda Dijkshoorn, Rita Setroikromo, Guiyuan Lv, Wim J. Quax
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2015）
- DOI
- 10.1007/s00253-015-6950-1
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
尽管大肠杆菌和酿酒酵母已被广泛用于萜类生物合成，但枯草芽孢杆菌具有天然MEP途径、GRAS安全性、快速生长和天然高产异戊二烯等优势，其作为萜类细胞工厂的潜力尚未被充分开发。本文综述了枯草芽孢杆菌生产萜类的代谢工程研究进展、面临挑战及未来方向。
研究策略
系统综述枯草芽孢杆菌固有的萜类生物合成途径（MEP途径、甲羟戊酸途径、下游途径等）、相关基因工程改造策略（如过表达dxs、dxr、idi，引入异源crtM/crtN等）、萜类检测与代谢组学方法，并总结研究瓶颈和展望。
核心内容
该文系统综述了枯草芽孢杆菌作为萜类化合物生产细胞工厂的代谢工程研究进展。作者梳理了枯草芽孢杆菌固有的甲基赤藓醇磷酸（MEP）途径各关键酶（dxs、dxr、ispD—H、idi）及其基因工程改造策略，并总结了引入异源基因（如金黄色葡萄球菌crtM/crtN）生产C30类胡萝卜素等下游产物的案例。关键结果表明，过表达dxs可使异戊二烯产量提升40%，而dxr过表达无显著效果；共表达dxs与dxr可使类胡萝卜素产量分别提高8倍和9.2倍，但摇瓶规模amorphadiene最高产量仅约20 mg/L，远低于大肠杆菌中紫杉二烯约1 g/L的水平。文章还指出MEP途径理论质量产率比甲羟戊酸途径高5%，且热、盐和氧化应激可诱导异戊二烯产生，但乙醇抑制其合成。该综述强调，尽管枯草芽孢杆菌具备GRAS安全性、快速生长和天然高产异戊二烯等优势，相关研究仍处早期，系统阐明MEP途径酶学和调控机制并结合代谢组学与约束模型进行优化，是释放其工业潜力的关键方向。
创新点
首次系统总结枯草芽孢杆菌代谢工程生产萜类化合物的研究进展；综合分析了MEP途径各关键酶的作用与争议；提出利用代谢组学和约束模型指导枯草芽孢杆菌萜类途径优化的新方向；整合了相关检测方法和质谱数据。
研究对象（11）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Bacillus subtilis | 甲基赤藓醇磷酸（MEP）途径 | dxs | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 | 催化 | MEP途径第一个限速酶，过表达使异戊二烯产量提高40%，类胡萝卜素产量提高8倍 |
| Bacillus subtilis | 甲基赤藓醇磷酸（MEP）途径 | dxr | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶 | 催化 | 过表达dxr对异戊二烯产量无显著影响，但类胡萝卜素产量提高9.2倍；其必要性存在争议 |
| Bacillus subtilis | 甲基赤藓醇磷酸（MEP）途径 | ispD | 4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇合酶 | 催化 | 编码ispD的基因缺失导致异戊二烯释放严重减少，必需酶 |
| Bacillus subtilis | 甲基赤藓醇磷酸（MEP）途径 | ispE | 4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶 | 催化 | MEP途径关键酶，对病原菌存活至关重要 |
| Bacillus subtilis | 甲基赤藓醇磷酸（MEP）途径 | ispF | 2-C-甲基-D-赤藓醇2,4-环二磷酸合酶 | 催化 | 基因缺失严重降低异戊二烯释放，必需酶 |
| Bacillus subtilis | 甲基赤藓醇磷酸（MEP）途径 | ispG | (E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸合酶 | 催化 | 催化机制尚不清楚，但对细胞存活必需 |
| Bacillus subtilis | 甲基赤藓醇磷酸（MEP）途径 | ispH | 4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶 | 催化 | 催化HMBDP还原为IPP和DMAPP（约5:1），基因缺失严重降低异戊二烯释放 |
| Bacillus subtilis | 甲基赤藓醇磷酸（MEP）途径 | idi | 异戊烯基二磷酸δ-异构酶（2型） | 催化 | 在枯草芽孢杆菌中为非必需酶，过表达idi与dxs和ads共表达可提高amorphadiene产量 |
| Bacillus subtilis | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtM, crtN | C30类胡萝卜素合酶（来自金黄色葡萄球菌） | 催化 | 异源表达crtM/crtN成功将MEP途径碳流导向C30类胡萝卜素，产生4,4'-二脱氢番茄红素和4,4'-二脱氢神经孢烯 |
| Bacillus subtilis | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtP, crtQ | 类胡萝卜素氧化酶（来自金黄色葡萄球菌） | 催化 | 与crtM/crtN共表达可产生糖基化C30类胡萝卜素酸 |
| Bacillus subtilis | 倍半萜生物合成途径 | ads | 无环法呢基二磷酸合酶（amorphadiene合酶） | 催化 | 与dxs和idi共表达，摇瓶amorphadiene最高产量约20 mg/L |
关键发现
- 萜类化合物超过60,000种，占天然产物词典记录的天然产物总数的24.11%（64,571/267,783）
- Bacillus属在萜类生物合成相关基因/蛋白报道中占47.32%
- 枯草芽孢杆菌ATCC 6051天然异戊二烯产率为7-13 nmol/g细胞/h
- MEP途径理论上葡萄糖转化为萜类的质量产率为30%，比甲羟戊酸途径高5%
- 过表达dxs使异戊二烯产量提高40%，而过表达dxr无显著变化
- 1%乙醇抑制异戊二烯产生，而热(48°C)、盐(0.3 M)和H2O2(0.005%)可诱导异戊二烯产生
- 过表达dxs和dxr使C30类胡萝卜素产量分别提高8倍和9.2倍
- 在枯草芽孢杆菌中共表达dxs、idi和ads（amorphadiene合酶）时，摇瓶规模amorphadiene最高产量约20 mg/L
- 大肠杆菌中紫杉二烯产量可达约1 g/L（文献报道）。
研究结论
枯草芽孢杆菌作为萜类生物合成细胞工厂具有理论潜力和诸多优势（快速生长、GRAS、宽底物范围、天然MEP途径、天然高产异戊二烯、遗传背景清晰等），但目前相关研究尚处早期阶段，缺乏足够的产量数据与大肠杆菌等进行比较。需要进一步阐明MEP途径酶的催化机制、动力学参数以及共调控作用，结合代谢组学与系统生物学方法，未来有望实现高产萜类生产。