Bioconversion of methanol to value-added mevalonate by engineered Methylobacterium extorquens AM1 containing an optimized mevalonate pathway
- 作者
- Wen-Liang Zhu, Jin-Yu Cui, Lan-Yu Cui, Wei-Fan Liang, Song Yang, Chong Zhang, Xin-Hui Xing
- 单位
- Department of Chemical Engineering, Tsinghua University, Beijing 100084, China; School of Life Sciences, Qingdao Agriculture University, Qingdao 266109, China
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2016）
- DOI
- 10.1007/s00253-015-7078-z
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解决以甲醇为原料生物合成高价值甲羟戊酸的问题，避免依赖粮食糖原料，并建立从甲醇到萜类化合物合成的平台途径。
研究策略
在Methylobacterium extorquens AM1中引入并优化异源甲羟戊酸途径；比较天然操纵子（MVE）和人工操纵子（MVH）；通过引入异源乙酰乙酰辅酶A硫解酶（phaA）增强底物供应；通过RBS工程调节phaA表达水平平衡途径；并进行补料分批发酵。
核心内容
本研究在甲基营养型细菌Methylobacterium extorquens AM1中引入并优化了异源甲羟戊酸途径，以实现以甲醇为原料生物合成高价值甲羟戊酸。研究比较了来源于粪肠球菌的天然操纵子（MVE）和由高活性HMGS（来自德国小蠊）与可溶性HMGR（来自克氏锥虫）构成的人工操纵子（MVH），摇瓶实验中后者产量较前者提高18%至66 mg/L。进一步引入异源乙酰乙酰辅酶A硫解酶（phaA）以增强底物乙酰辅酶A供应，产量提升至180 mg/L，为天然操纵子菌株的3.2倍；随后通过RBS工程上调phaA表达水平实现途径平衡，最优菌株AM1-ARBSU1的摇瓶产量达215 mg/L。在补料分批发酵中，该菌株甲羟戊酸产量达到2.22 g/L，总产率28.4 mg/g甲醇，生产率7.16 mg/L/h。胞内HMG-CoA浓度随乙酰乙酰辅酶A硫解酶表达上调而积累，与产量呈正相关。该研究首次在M. extorquens AM1中实现了从甲醇到甲羟戊酸的高效生物转化，为基于一碳原料的萜类化合物合成提供了可行的平台途径。
创新点
首次在M. extorquens AM1中构建并优化甲羟戊酸途径从甲醇生产甲羟戊酸；使用高活性的HMGS和HMGR（来自德国小蠊和克氏锥虫）构建人工操纵子；通过引入并调节异源AACoAT表达显著提高产量；RBS工程实现途径平衡；补料分批发酵达到2.22 g/L。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Methylobacterium extorquens AM1 | 甲羟戊酸途径 | mvaS | HMG-CoA synthase (HMGS) | 催化 | 来自粪肠球菌（Enterococcus faecalis），催化HMG-CoA合成 |
| Methylobacterium extorquens AM1 | 甲羟戊酸途径 | mvaE | MvaE（双功能蛋白，具有HMGR和AACoAT活性） | 催化 | 来自粪肠球菌，同时具有HMG-CoA还原酶和乙酰乙酰辅酶A硫解酶活性 |
| Methylobacterium extorquens AM1 | 甲羟戊酸途径 | hmgs1 | HMG-CoA synthase (HMGCS1) | 催化 | 来自德国小蠊（Blattella germanica），具有报道的最高HMGS活性 |
| Methylobacterium extorquens AM1 | 甲羟戊酸途径 | tchmgr | 可溶性HMG-CoA reductase (tHMGR) | 催化 | 来自克氏锥虫（Trypanosoma cruzi），去掉N端膜锚定区，具有报道的最高HMGR活性 |
| Methylobacterium extorquens AM1 | 甲羟戊酸途径 | phaA | 乙酰乙酰辅酶A硫解酶 (AACoAT) | 催化 | 来自真养产碱杆菌（Ralstonia eutropha），强化乙酰乙酰辅酶A供应 |
关键发现
- 摇瓶培养中，携带天然操纵子MVE的菌株AM1-mve甲羟戊酸产量为56 mg/L
- 携带人工操纵子MVH的菌株AM1-mvh产量为66 mg/L（比MVE高18%）
- 引入phaA基因构建的AM1-mvt产量为180 mg/L（为MVE的3.2倍）
- 通过RBS工程上调phaA表达，AM1-ARBSU1产量达到215±9 mg/L（比MVT高20%）。补料分批发酵中，最佳菌株AM1-ARBSU1的甲羟戊酸产量达到2.22 g/L，总产率为28.4 mg甲羟戊酸/g甲醇，生产率为7.16 mg/L/h。细胞内HMG-CoA浓度随AACoAT表达上调而积累，与甲羟戊酸产量正相关。
研究结论
本研究成功在M. extorquens AM1中实现了从甲醇到甲羟戊酸的生物转化，通过途径工程和发酵优化，产量达到2.22 g/L，为后续萜类化合物合成提供了平台，证明了甲基营养型合成路线的可行性。